Anticorpi ENA-Blot (SS-A, SS-B, RNP, Scl-70, Jo-1, Sm)

Informații generale

Bolile autoimune sistemice se caracterizează prin prezența în titruri crescute a autoanticorpilor față de proteine intracelulare și acizi nucleici. Acești autoanticorpi sunt denumiți generic anticorpi antinucleari (ANA) datorită faptului sunt îndreptați predominant împotriva antigenelor nucleare, dar ei includ și anticorpi anticitoplasmatici.

Detectarea ANA are o mare sensibilitate, de aceea este considerat cel mai bun test de screening pentru bolile reumatice sistemice. Prevalența ANA în aceste afecțiuni se situează între 20 și 100%. Pentru identificarea bolilor reumatismale este  foarte importantă diferențierea ANA^1;5;6. Astfel, sunt descrise în prezent două categorii principale de anticorpi antinucleari:

1. Autoanticorpi ce au drept țintă antigenică ADN-ul și histonele;
2. Autoanticorpi ce au drept țintă antigene nucleare solubile (extractable nuclear antigens = ENA).

Denumirea ENA provine din faptul că aceste antigene au fost extrase inițial din nuclei cu soluție salină. Primii anticorpi ENA identificați au fost cei îndreptați împotriva antigenului Smith (Sm, 1966); ulterior au fost descrise și alte subtipuri ENA în care au fost incluse alături de antigenele nucleare și componente citoplasmatice solubile. Principalele antigene utilizate în mod curent în laboratoarele de imunologie sunt: ribonucleoproteine (RNP), Sm, SS-A /Ro, SS-B/La, Scl-70 și Jo-1. Deși cei mai mulți anticorpi  anti-ENA prezintă asocieri specifice cu anumite boli pot exista uneori suprapuneri semnificative⁷.

Anticorpii anti-U1nRNP și Sm sunt îndreptați împotriva  unor antigene care aparțin grupului de ribonucleoproteine mici (snRNP). Acestea sunt complexe formate din  ARN  cu un conținut înalt de uridină (U-RNA)  și diverse proteine având o greutate moleculară de 9-70 kDa. Prin cromatografie au fost puse în evidență 5 tipuri de U-RNA: U1, U2, U4, U5 și U6. Particulele de U-nRNP conțin 6 proteine core sau Sm (B, B’, D, E, F, G), iar U1-RNP conține în plus proteine  specifice (70K, A, C). Astfel, anticorpii anti – U1 RNP reacționează cu una sau mai  multe proteine specifice în timp ce anticorpii anti-Sm reacționează cu una sau mai multe proteine core. Acțiunea snRNP este esențială pentru eliminarea intronilor din pre-ARN-ul mesager (procesul de splicing), rezultând ARNm care va fi exportat din nucleu  și implicat in procesul de translație  a proteinelor de la nivelul ribozomilor.

Titruri crescute de anticorpi  anti-U1 RNP se  întâlnesc cu o prevalență de 95-100%  în boala mixtă de țesut conjunctiv (sindromul Sharp), constituind unul din criteriile de diagnostic al acestei afecțiuni. Titrul de anticorpi se corelează de asemenea cu gradul de activitate a bolii. Anticorpii anti-U1 RNP mai pot fi întâlniți și  la pacienti cu LES (15-40%), scleroză sistemică și polimiozită^1;3.

Anticorpii anti-Sm  sunt îndreptați  asupra antigenului Sm, denumit astfel după primul pacient (Stephanie Smith) la care a fost pus în evidență. Antigenul Sm face parte din grupul snRNP implicate în procesul de splicing al ARN-ului mesager. Anticorpii anti-Sm sunt întâlniți la 5-40% din  pacienții cu LES având o specificitate înaltă (peste 90%) pentru boala lupică.  Împreună cu anticorpii anti-ADN dublu catenari pot fi considerați patognomonici pentru această condiție clinică și fac parte din criteriile ACR  de diagnostic al LES⁴.

Anticorpii anti-SS-A (Ro)sunt  îndreptați împotriva unui antigen care face parte tot din grupul  ribonucleoproteinelor mici (soluble substance A sau Robert antigen).  Acesta este compus dintr-o moleculă ARN (Y1, Y2, Y3, Y4 sau Y5) și o proteină de 60 kDa. Complexul poate asocia și o proteină de 52 kDa (Ro52) ,dar  acest lucru este încă controversat în literatura de specialitate. Diverse studii au arătat că serurile pozitive pentru SS-A conțin întotdeauna anticorpi împotriva proteinei native SS-A  de  60 kDa și adițional pot avea  și anticorpi îndreptați împotriva proteinei Ro52. Diferențierea de anticorpii anti-Ro52 are importanță diagnostică, deoarece aceștia  sunt nespecifici, putând fi detectați într-o multitudine de afecțiuni.

Anticorpii anti-SS-A sunt asociați cu diverse boli autoimune: Sindrom Sjögren (40-95% din  cazuri), LES (20-60%), ciroză biliară primitivă (20%). Trebuie menționat că acești autoanticorpi apar în 100% din cazurile de lupus  neonatal. Pot fi întâlniți de asemenea în hepatitele autoimune sau virale.

Anticorpii anti-SS-B (La)  sunt îndreptați împotriva unei proteine ce deține un rol în transcripția  ARN polimerazei III (soluble substance B sau Lane antigen). La reprezintă probabil un factor de finalizare a transcripției care se leagă de capătul 3′ al produșilor de transcripție nou-generați ai ARN polimerazei III. Anticorpii anti-SS-B apar de obicei împreună cu anti-SS-A, fiind asociați cu aceleași condiții clinice^1;6;7.

Anti-Ro52 sunt îndreptați împotriva unui antigen de 52 kDa și au fost descriși ca autoanticorpi nespecifici asociați atât cu boli reumatice cât și non-reumatice. Sunt prezenți într-un procent de 100% la mamele feților sau nou-născuților cu bloc atrio-ventricular congenital sau lupus neonatal¹.

Anticorpii anti-Scl-70 sunt îndreptați împotriva unei proteine non-histonice de 70 kDa, izolată inițial din nuclei de celule hepatice provenite de la șobolan. Ulterior, s-a demonstrat că această proteină este un produs de degradare al ADN topoizomerazei I, o clasă de enzime localizate în nucleoplasmă și nucleoli, având funcția de a menține integritatea informațională a ADN (prin  capacitatea de a scinda și de a reuni la loc unul din cele două lanțuri ADN).

Anticorpii anti-Scl-70 se găsesc la 40% din pacienții cu scleroză sistemică forma difuză și la 10% din pacienții cu scleroză sistemică forma limitată, fiind un element de prognostic nefavorabil.

Anticorpii anti-Jo-1 sunt îndreptați împotriva enzimei histidil-t-ARN sintetaza. In vitro acești autoanticorpi se leagă de epitopii conformaționali ai enzimei și îi inhibă activitatea catalitică. Antigenul este sub formă dimerică și este localizat  în citoplasmă; masa moleculară a subunităților este 50 kDa. Anticorpii anti-Jo-1 constituie un marker serologic pentru dermatomiozită/polimiozită, având o prevalență de 20-40%. Prezența acestor autoanticorpi se asociază cu o formă mai severă de boală, cu un prognostic rezervat și recăderi mai frecvente. Autoanticorpii pot fi detectați precoce, uneori precedând debutul simptomelor. La copii anticorpii anti-Jo-1 sunt extrem de rari^1;3;6;7.

Recomandări pentru determinarea anticorpilor ENA BLOT –  evaluarea pacienților cu  testul ANA  IIF (imunofluorescență indirectă) pozitiv și cu semne clinice sugestive de  afecțiune  reumatismală sistemică. În general nu se recomandă efectuarea ENA în prezența unui rezultat ANA IIF negativ decât dacă pacientul are semne clinice evidente de boală reumatismală și în special de sindrom Sjögren sau polimiozită (testul ANA poate fi uneori negativ în prezența unor anticorpi față de antigene foarte solubile, cum ar fi SS-A/Ro sau față de antigene citoplasmatice exprimate insuficient pe preparatele Hep-2 sau alte țesuturi, cum ar fi Jo-1)⁵.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)².

Specimen recoltat – sânge venos².

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator².

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare².

Volum probă – minim 0.5 mL ser².

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian².

Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 4°C; timp mai îndelungat la -20 °C².

Metodă – imunoblot. Testul utilizează 7 antigene native si recombinate purificate, care sunt fixate  in cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici aceștia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va atașa la porțiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluția de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecție enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacția enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariția unei reacții de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect.

Valori de referință  și interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcție de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

Valori de referință²

Bibliografie