Testul NBT (nitrobluetetrazolium)

Informații generale Testul NBT (nitrobluetetrazolium)

Boala granulomatoasă cronică (CGD) este o boală genetică (ereditară) caracterizată prin incapacitatea celulelor fagocitare ale organismului (denumite şi fagocite) de a produce peroxizi de hidrogen şi alţi oxidanţi, necesari pentru a distruge anumite microorganisme. Boala granulomatoasă cronică (CGD) este cauzată de mutațiile uneia dintre cele cinci gene care codifică subunitățile complexului enzimatic fagocitar NADPH oxidază (phox)¹.

Deficiența de enzimă phox are ca rezultat producția defectuoasă a speciilor reactive ale oxigenului. CGD se caracterizează astfel prin apariția unor infecții bacteriene și fungice recurente severe, precum și a unor complicații hiperinflamatorii (cele mai semnificative la nivel pulmonar, gastrointestinal și urinar)². Această boală se asociază, de asemenea cu acumularea excesivă a celulelor sistemului imun în agregate numite granuloame (de unde şi numele bolii) la locul infecţiei sau al unei inflamaţii.

Deşi fagocitele pacienţilor cu CGD pot migra normal către locul infecţiei, pot ingera microbii care produc infecţia şi chiar degranula enzimele digestive şi alte substanţe microbiene în fagozom, ei nu au maşinăria enzimatică producătoare de peroxizi de hidrogen şi alţi oxidanţi. Astfel, fagocitele pacienţilor cu CGD pot apăra organismul de anumite tipuri de infecţii, dar nu şi de cele care necesită în mod specific peroxidul de hidrogen pentru a controla infecţia. Defectul lor în apărarea împotriva infecţiilor se limitează doar la anumite bacterii şi fungi. Pacienţii cu CGD au o imunitate normală pentru majoritatea virusurilor şi pentru anumite bacterii şi fungi. De aceea ei nu au infecţii tot timpul.

Testele clinice de diagnosticare pentru CGD se bazează pe măsurarea producției de superoxid O₂⁻. Dupa o imagistică concludentă și identificarea agentului patogen, managementul convențional al CGD se bazează pe profilaxia antimicrobiană, tratamentul prelungit al infecțiilor bacteriene și fungice și utilizarea precaută a corticosteroizilor pentru complicațiile inflamatorii³. Transplantul alogen de celule stem hemopoietice (allo-HSCT) de la un donator compatibil HLA este singurul tratament cunoscut pentru CGD și este indicat la începutul vieții, la pacienții fără producție reziduală de O₂^{– 1,4}.

Cel mai simplu și cel mai rapid test pentru diagnosticarea CGD este testul NBT. Neutrofilele dintr-o probă de sânge periferic sunt activate pentru a produce superoxid, care este detectat de NBT.  Acesta este transformat dintr-un compus incolor, solubil în apă, într-un formazan insolubil albastru închis, care poate fi detectat la microscop.

Cea mai eficientă și informativă versiune este testul cu lame NBT, în care o picătură de sânge integral este întinsă pe o lamă, la microscop, acoperită cu un agent de activare, cum ar fi lipopolizaharidă sau ester de forbol. Fagocitele care aderă la lamă sunt activate și dezvoltă incluziuni albastre la incubarea cu NBT. Numărul de celule NBT-pozitive este marcat la microscop. Deși rezultatul nu este cantitativ, un tehnucian experimentat poate diferenția în mod fiabil fagocitele normale de activitatea phox cu nivel scăzut, observată în unele cazuri de deficiență de p47.

Testul NBT poate fi util în identificarea indivizilor de sex feminin purtători de boala cromozomială legată de cromozomul X,  atunci când fagocitele periferice sunt reprezentate de 2 populații de celule: una care reduce NBT la formazan și una care nu reduce NBT.

Acest test poate fi deci, util pentru detectarea tipului de boală legată de X, în care mamele purtătoare etalează în circulațieun mozaic de celule normale și anormale^,5,6.

 Recomandări pentru determinarea testului NBT

• Diagnosticul bolii granulomatoase cronice⁶

Specimen recoltat – sânge venos⁶

Volum probă – 0.5 mL⁶

Metodă – microscopică^6,7

Testul cu NBT necesită o cantitate mică de sânge periferic. Se amestecă 0.1 mL de sânge cu 0.1 mL de tetrazoliu nitro-albastru 0.2% în soluție salină și 0.1 mL de soluție salină. Acest amestec este intubat la 37°C timp de 15 minute și apoi menținut la temperatura camerei timp de 15 minute⁷.

Frotiurile se fac pe o lamă de sticlă și se fixează cu metanol timp de 3 minute și apoi se colorează cu colorant Pappenheim timp de 3-5 minute. Neutrofilele care ingerează colorantul și au o explozie oxidativă creează depozite mari de formazan negru în citoplasmă⁷.

Valori de referință

În testul NBT, neutrofilele schimbă compusul incolor NBT într-un compus cu o culoare albastru intens. Dacă acest test este negativ (adică nu se produce  culoarea albastră), atunci acesta indică un defect în activitatea NADPH oxidază generatoare de superoxid, cu incapacitate bactericidă ( de a ucide eficient bacteriile fagocitate)⁶.

Limite și interferențe

Rezultatele testului depind foarte mult de tehnica de manipulare a probei recoltate¹.

Rezultatele fals negative apar atunci când formazanul se acumulează în celulele cu niveluri scăzute de NADPH¹.

Bibliografie

1. Seger R.A. (2016). Chronic Granulomatous Disease. Encyclopedia of Immunobiology, Vol: 5, Page: 485-493, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-374279-7.18020-8
2. Javvaji, P. K., Dhali, A., Francis, J. R., Kolte, A. P., Mech, A., Roy, S. C., Mishra, A., & Bhatta, R. (2020). An Efficient Nitroblue Tetrazolium Staining and Bright-Field Microscopy Based Method for Detecting and Quantifying Intracellular Reactive Oxygen Species in Oocytes, Cumulus Cells and Embryos. Frontiers in cell and developmental biology, 8, 764. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00764
3. Yu, J. E., Azar, A. E., Chong, H. J., Jongco, A. M., 3rd, & Prince, B. T. (2018). Considerations in the Diagnosis of Chronic Granulomatous Disease. Journal of the Pediatric Infectious Diseases Society, 7(suppl_1), S6–S11. https://doi.org/10.1093/jpids/piy007
4. Jambunathan N. (2010). Determination and detection of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation, and electrolyte leakage in plants. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 639, 292–298. https://doi.org/10.1007/978-1-60761-702-0_18
5. Agarwal, A., & Majzoub, A. (2017). Laboratory tests for oxidative stress. Indian journal of urology: IJU: journal of the Urological Society of India, 33(3), 199–206. https://doi.org/10.4103/iju.IJU_9_17
6. Kuhns D. B. (2019). Diagnostic Testing for Chronic Granulomatous Disease. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1982, 543–571. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9424-3_33
7. Molehin A.J, Nichols J., Smith F., Nugent K. (2021). Phagocytosis: Biology and Methods, Reference Module in Biomedical Sciences, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-818731-9.00086-0