ARN Viral SARS-CoV-2

Test diagnostic COVID-19 RT-PCR (Coronavirus) este disponibil toate centrele Synevo din țară și se poate efectua atât la cerere, cât și în baza unei programări.

Recoltarea la cerere se poate efectua oricând în timpul săptămânii, în intervalul orar alocat recoltării.

Pentru zilele de sâmbătă, recoltarea este disponibilă doar în centrele dedicate de mai jos:

• Arad: Laborator Arad, Banu Mărăcine;
• București: Plevnei, Ștefan cel Mare, I.O.R, Olteniței, Unirii, Drumul Taberei 1, Drumul Taberei 2;
• Buzău: Unirii;
• Oradea: Coposu, Decebal;
• Pitești: Teiuleanu, Victor Babeș;
• Ploiești: Gheorghe Doja, Republicii Nord;
• Râmnicu Vâlcea: Râmnicu Vâlcea 1;
• Timișoara: Laborator, Teiului, Tudor Vladimirescu.

Acest test nu este disponibil in zilele de duminică.

Timpul de eliberare al rezultatelor este de:

• 1 zi lucrătoare de la momentul recoltării pentru Arad, Oradea și Timișoara.
• 2 zile lucrătoare de la momentul recoltării pentru restul orașelor din țară.

Rezultatul testului RT PCR este disponibil în contul online de accesare a rezultatelor atât în limba română, cât și în limba engleză.

Dacă se optează pentru eliberarea rezultatului testului RT PCR într-una dintre recepțiile Synevo, se va comunica rezultatul testului în limba romană, versiunea în limba engleză urmând a se comunica pacientului doar la solicitarea expresă a acestuia.

SARS-CoV-2 (coronavirusul sindromului respirator acut sever 2) – ARN: RT-PCR

Coronavirusurile (CoVs) sunt virusuri ARN aparținând ordinului Nidovirales, familia Coronaviridae, subfamilia Orthocoronavirinae, care infectează omul și o varietate largă de animale (păsări și mamifere)1. Denumirea acestora provine de la aspectul virionilor în microscopia electronică, ce se remarcă prin prezența unor spiculi proeminenți, de natură glicoproteică, dispuși sub formă de coroană la suprafața particulelor virale.

Spiculii au rolul de a se lega de anumiți receptori celulari, favorizând infecția celulelor receptive². CoVs sunt clasificate în patru genuri: Alfa-, Beta-, Delta și Gammacoronavirus. Numeroase CoVs au fost detectate la lilieci care ar deține un rol crucial în evoluția acestor virusuri, în special a genurilor alfa și beta-CoVs. Și alte specii de animale pot servi drept gazdă pentru CoVs și rezervor pentru răspândirea la om¹.

Până în prezent sunt cunoscute 7 subtipuri de coronavirusuri responsabile de infecții în populația umană. În timp ce alfa-CoV determină infecții ușoare/moderate sau asimptomatice, beta-CoV pot produce afectări severe ale tractului respirator, cu potențial letal3. Cele trei beta-Covs zoonotice care au traversat bariera de specie și au cauzat pneumonie fatală la om în secolul 21 sunt: coronavirusul sindromului respirator acut sever (SARS-CoV) responsabil de epidemia SARS declanșată în anul 2002 în provincia Guangdong din China, coronavirusul sindromului respirator din Orientul Mijlociu (MERS-CoV) care a determinat epidemia de infecție respiratorie izbucnită în 2012 în Peninsula Arabică și noul CoV, denumit inițial 2019-nCoV și ulterior SARS-CoV-2, descoperit în decembrie 2019 în Wuhan, provincia Hubei din China, secvențiat și izolat în ianuarie 2020, care a cauzat pandemia actuală de pneumonie atipică4.

SARS-CoV-2 aparține genului Betacoronavirus, subgenul Sarbecovirus, ca și SARS-CoV cu care este strâns înrudit¹. Genomul SARS-CoV-2 este constituit dintr-o singură moleculă de ARN monocatenar, cu polaritate pozitivă, dimensiune de aproximativ 30 kb, care prezintă secvențe nucleotidice identice cu SARS-CoV în procent de 79.5%. Genomul conține la capătul 5’ două cadre deschise de citire (open reading frames, ORF), ORF1a și ORF1b, care codifică 16 proteine non-structurale (de exemplu, ARN polimeraza ARN-dependentă, RdRp).

La capătul 3’ al genomului se găsesc genele care codifică 4 proteine structural majore: glicoproteina S (proteina structurală a spiculilor), proteina E de înveliș, proteina M de membrană și proteina N a nucleocapsidei. Genomul ARN și proteina N formează o nucleocapsidă cu simetrie helicoidală, înconjurată de învelișul extern. ARN-ul este infecțios, servind atât ca genom, cât și ca ARNm viral^5,6.

Glicoproteina S SARS-CoV-2 permite virusului să pătrundă în celulele gazdă, utilizând enzima 2 de conversie a angiotensinei (angiotensin convertaza 2, ACE2,) ca receptor de intrare, față de care prezintă o afinitate mult mai mare, comparativ cu glicoproteina S SARS-CoV7. ACE2, similară ca structură cu ACE, constituie un factor reglator negativ al sistemului renină-angiotensină-aldosteron8.

ACE2 este o proteină membranară integrală de tip I, care este exprimată și devine activă în mai multe tipuri de celule, cum ar fi celulele epiteliale alveolare, enterocitele și celulele endoteliale din rinichi și cord. Celulele epiteliale alveolare și enterocitele reprezintă ținte pentru SARS-CoV⁹. Din punct de vedere clinic, SARS-CoV-2 determină o infecție respiratorie denumită COVID-19 (Coronavirus infectious disease – 2019).

Timpul dintre expunerea inițială la virus și debutul simptomelor (perioada de incubație) este de 2-14 zile în 95% din cazuri, cu o medie de 5-6 zile, ceea ce indică că este necesară o perioadă de carantină de minum 14 zile a contacților¹⁰. Boala este caracterizată prin simptomatologie predominant respiratorie: febră, tuse seacă, dispnee de severitate variabilă si poate evolua către pneumonie bilaterală interstițială, insuficiență respiratorie sau detresă respiratorie acută (ARDS) care este principala cauză de mortalitate.

Persoanele cu vârstă peste 60 de ani, precum și cele cu comorbidități (cum ar fi, hipertensiune arterială, diabet zaharat, boală cronică de rinichi) prezintă un risc mai mare de boală severă. Există și cazuri cu manifestări gastrointenstinale (mai ales diaree), iar la unii pacienți (în special la cei tineri) au fost semnalate hipo/anosmie (pierderea mirosului) și hipo/disgeuzie (pierderea gustului) ca simptome precoce¹¹. Fiziopatologia ARDS indus de SARS-CoV-2 este similară cu cea a pneumoniei comunitare severe cauzată de alte virusuri sau bacterii.

Producția excesivă de citokine proinflamatorii (factorul de necroză tumorală alfa, interleukin 6 și interleukina 1 beta), descrisă ca o “furtună de citokine” se asociază cu un risc crescut de hiperpermeabilitate vasculară și insuficiență multiplă de organ, cu o rată mare de mortalitate¹². Diagnosticul de laborator al infectiei cu COVID-19 poate urma două căi: – evidențierea virusului prin tehnici de amplificare a materialului genetic viral (teste RT-PCR) – detecția anticorpilor specifici – care reprezintă răspunsul imun al organismului la virus.

 Evidențierea ARN-ului viral SARS-CoV-2 prin metoda RT-PCR Pe data de 2 martie 2020 Organizația Mondială a Sănătății (OMS) a elaborat și publicat protocolul de diagnostic al infecției SARS-CoV-2. Conform acestui ghid se recomandă prelevarea de probe provenind din tractul respirator superior (exsudat nazofaringian sau faringian), preferabil împreună cu sânge și alte probe din tractul respirator inferior (spută sau lavaj bronhoalveolar – în cazul formelor grave de boală). Din aceste probe se face identificarea virală prin metoda RT-PCR (reverstranscriere – reacție în lanț a polimerazei).

Proba se consideră pozitivă dacă se detectează cel puțin două secvențe țintă ale genomului viral SARS-CoV-2, dintre care cel puțin una să fie specifică SARS-CoV-2, utilizând un test RT-PCR validat¹³. Testarea prin metoda RT-PCR se recomanda urmatoarelor categorii de persoane/pacienti:

1. Pacienţi înainte de procedura de transplant (asimptomatici) şi donatorii de organe, ţesuturi şi celule stem hematopoietice înainte de donare; pacienți cu transplant de organe, ţesuturi şi celule stem hematopoietice aflați în tratament imunosupresor, înaintea fiecărei internări din perioada de monitorizare posttransplant – 2 teste la 24 de ore interval;
2. Pacienţi asimptomatici cu imunosupresie în contextul bolii sau indusă medicamentos la internare în spital – 2 teste la 24 de ore interval;
3. Pacienți oncologici asimptomatici aflați în curs de chimioterapie și/sau radioterapie – de 2 ori pe lună;
4. Pacienți oncologici asimptomatici înainte de intervenții operatorii sau manevre invazive;
5. Hemodializaţi
6. Gravidele asimptomatice care au fost contact apropiat cu un caz confirmat;
7. Personal sanitar asimptomatic contact direct cu caz confirmat, în a 6-7 zi de la ultimul contact posibil infectant14.
8. Persoanele in vederea reluarii activitatii profesionale
9. Persoanele in vederea deplasarii in afara tarii in interes personal sau professional
10. Contacți ai cazurilor confirmate
11. Personal medico-sanitar asimptomatic contact direct cu caz confirmat, în a 6-7 zi de la ultimul contact posibil infectant
12. Persoane care prin natura activitatii profesionale desfasurate sunt mai frecvent expusi la agentii infectiosi

Specimen recoltat – Tampoane de exsudat nazofaringian și faringian recoltate conform procedurilor standard, descărcate în recipient cu mediu de transport care să asigure viabilitatea virusurilor^14,15.

Exsudat nazofaringian – Solicitați pacientului să tușească pentru a mobiliza secrețiile către faringele posterior. Inclinați spre spate capul pacientului într-un unghi de aproximativ 70 de grade. Tamponul se introduce cu grijă în narină si se coboară pe planșeul inferior al acesteia până când se ajunge în nazofarinx. Tamponul se răsucește de 2-3 ori, după care se extrage ușor. Acesta va fi imersat în recipientul cu mediu de transport și se închide capacul etanș. În timpul acestei operațiuni pacientul poate simți o anumită presiune sau discomfort.

Exsudatul faringian se prelevă înainte sau după 4 ore de la toaleta cavităţii bucale sau ingestia de alimente sau lichide. Se aşează pacientul pe scaun cu faţa spre sursa de lumină, gâtul în uşoară extensie şi ceafa sprijinită de spătar sau perete. Se deprimă baza limbii cu apăsătorul şi, în timp ce pacientul pronunţă vocala “a”, se şterg ferm cu tamponul amigdalele şi peretele posterior al faringelui. Atât la introducerea cât şi la scoaterea tamponului, se evită atingerea bazei limbii şi a palatului moale.

Ambele tampoane – nazofaringian si orofaringian – se vor introduce in același recipient cu mediu de transport.

Stabilitate probă – eșantioanele trebuie procesate și testate cât mai repede. Daca acest lucru nu este posibil, proba este stabilă refrigerată (2 – 8°C) maxim 5 zile¹⁵. Probele vor fi etichetate corespunzător si vor fi insotite de Formularul de însoțire probe recoltate de la cazul suspect de COVID-19^14,15.

Metoda – RT-PCR¹⁵. Testul utilizează amplificarea selectivă a două secvențe țintă ale genomului viral SARS-CoV-2: o secvență localizată în regiunea ORF1a specifică pentru SARS-COV-2 si o secvență conservată din gena E comună subgenului Sarbecovirus. Pentru monitorizare extracției și amplificării se adaugă în fiecare probă analizată un control ARN intern, reprezentat de o secvență necompetitivă care nu prezintă omologie cu genomul viral¹⁵.

Valori de referință – Nedetectabil (Negativ)¹⁵.

Interpretarea rezultatelor – Un rezultat pozitiv indică prezența în proba analizată a ARN-ului SARS-COV-2, fiind sugestiv pentru diagnosticul COVID-19. Un rezultat nedetectabil (negativ) indică absența în proba analizată a ARN-ului SARS-COV-Cu toate acestea nu poate fi exclusă prezența unei infecții cu noul coronavirus, având în vedere faptul că rezultatul RT-PCR poate fi influențat atât de stadiul infecției cât și de calitatea specimenului recoltat.

Un rezultat repetat invalid (absența amplificării controlului intern), determinat cel mai probabil de o inhibiție a reacției RT-PCR, impune repetarea testului pe o nouă probă. Un rezultat echivoc: Testul utilizeaza amplificarea selectiva a ARN viral din regiunea Orf1/a specifica pentru SARS-COV-2 si din gena E (proteina structurala ce formeaza anvelopa), o regiune comuna pan-Sarbecovirusurilor. 

Nu s-a obtinut amplificare pentru tinta specifica SARS-COV-2, Orf1/a, ci doar pentru regiunea pan-Sarbecovirus. Posibil interferenta cu alte Sarbecovirusuri sau prezenta tintei la limita inferioara de detectie a metodei. Se recomanda repetarea testarii printr-o alta metoda RT-PCR. Rezultatul se va interpreta in context clinico-epidemiologic.

Bibliografie:

1. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Factsheet for health professionals on Coronaviruses. Factsheet for health professionals on Coronaviruses. Ref Type: Internet Communication. https://www.ecdc.europa.eu/en/factsheet-health-professionals-coronaviruses.
2. Tortorici MA, Veesler D. Structural insights into coronavirus entry. Adv Virus Res. 2019;105:93-116.
3. Velavan TP, Meyer CG. The COVID-19 Epidemic. Trop Med Int Health. 2020 Mar; 25(3): 278–280.
4. Walls AC, Park YJ, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell. 2020 Apr 16;181(2):281-292.e6.
5. Zhang J, Zeng H, Gu J, Li H, Zheng L, Zou Q. Progress and Prospects on Vaccine Development against SARS-CoV-2. Vaccines (Basel). 2020 Mar 29;8(2).
6. Guo YR, Cao QD, Hong ZS, Tan YY, Chen SD, Jin HJ, Tan KS, Wang DY, Yan Y. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Mil Med Res. 2020 Mar 13;7(1):11.
7. Wrapp D, Wang N, Corbett KS, Goldsmith JA, Hsieh CL, Abiona O, Graham BS, McLellan JS. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020 Mar 13;367(6483):1260-1263.
8. Kuba K, Imai Y, Penninger JM. Multiple functions of angiotensin-converting enzyme 2 and its relevance in cardiovascular diseases. Circ J. 2013;77(2):301-8.
9. Hamming I, Timens W, Bulthuis ML, Lely AT, Navis G, van Goor H. Tissue distribution of ACE2 protein, the functional receptor for SARS coronavirus. A first step in understanding SARS pathogenesis. J Pathol. 2004 Jun;203(2):631-7.
10. Linton NM, Kobayashi T, Yang Y, Hayashi K, Akhmetzhanov AR, Jung SM, Yuan B, Kinoshita R, Nishiura H. Incubation Period and Other Epidemiological Characteristics of 2019 Novel Coronavirus Infections with Right Truncation: A Statistical Analysis of Publicly Available Case Data. J Clin Med. 2020 Feb 17;9(2).
11. Comisia de Microbiologie Medicală a Ministerului Sănătății. Comisia de Microbiologie Medicală a Colegiului Medicilor din România. Infecția cu SARS-CoV-2. Ref Type: Internet Communication https://www.ms.ro/wp-content/uploads/2020/04/Recomandarea-Comisiilor-de-Microbiologie- Medical%C4%83-a-MS-%C8%99i-CMR-Diagnostic-SARS-CoV-2.pdf.
12. Jose RJ, Manuel A. COVID-19 Cytokine Storm: The Interplay Between Inflammation and Coagulation. Lancet Respir Med. 2020 Apr 27;S2213-2600(20)30216-2.
13. World Health Organization. Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected human cases. Interim guidance 2 March 2020. Ref Type: Internet Communication. https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/331329/WHO-COVID-19-laboratory-2020.4-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y.
14. Metodologia de supraveghere a sindromului respirator acut cu noul coronavirus (COVID-19), Actualizare 28.04.2020. Ref Type: Internet Communication. https://www.cnscbt.ro/index.php/info-medical/1596-metodologia-de-supraveghere-a-covid-19-actualizare-27-03-2020/file
15. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2020. Ref Type: Catalog