Citochimia se bazează pe studiul microscopic al componenţilor chimici celulari: nucleoproteine, proteine, hidraţi de carbon, lipide şi enzime.
Coloraţiile citochimice oferă informaţii în legătură cu linia celulară şi diferenţierea celulelor hematopoietice şi joacă un rol important în evaluarea anomaliilor hematologice, în special în diagnosticul diferenţial şi clasificarea bolilor maligne ale sângelui.
Un principiu de care trebuie ţinut seama este faptul că, o reacţie pozitivă este întotdeauna valoroasă, în timp ce reacţia negativă este neconcludentă. Pentru certitudine, în majoritate cazurilor reacţiile citochimice se practică cu un martor pozitiv al reacţiei1;2.
|
Reactii citochimice
|
LAM – M1,M2 |
LAM – M3 |
LAM – M4 |
LAM – M5 |
LAM –M6 |
LAM – M7 |
LAL |
|
MPO
|
+
|
++
|
+
|
– , +/-
|
–
|
–
|
–
|
|
PAS
|
– , +/-
|
– , +
|
– , +/-
|
– , +
|
+
|
+
|
– , + , ++
|
|
ANAE
|
–
|
– , +
|
+
|
++
|
+
|
+
|
– , +/-
|
-negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv
Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB şi LAL necesită coroborarea datelor de microscopie optică – morfologie şi coloraţii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronică.
Informaţii generale
Esterazele sunt enzime care hidrolizează esteri alfatici şi aromatici şi sunt utile pentru a distinge celulele seriei granulocitare de celulele seriei monocitare.
Naphthol AS-D cloracetat esteraza este prezentă în celulele liniei granulocitare şi se găseşte în cantitate mică sau este absentă în monocite şi precursorii monocitelor.
Esteraza nespecifică este, aşa cum îi arată şi numele, o enzimă ubiquitară prezentă în mai multe tipuri de celule, printre care: monocite, celule T şi megacariocite. Poate utiliza ca substraturi: alfa-naftil acetat, alfa-naftil butirat, naftol AS- D acetat4.
Principiul metodei
Ne vom referi la reacţia alfa-naftil acetat esteraza (ANAE): alfa-naftil acetatul este hidrolizat de esteraze în alfa-naftol, care în prezenţa unei sări de diazoniu formează un compus de culoare roşu-brun, insolubil în apă1;3.
Recomandări pentru determinarea esterazelor nespecifice
– diagnosticul LA monocitare tipurile M4 si M51.
Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)3.
Specimen recoltat
a) sânge capilar şi/sau aspirat medular – frotiuri
b) se recomandă recoltarea simultană de sânge venos pentru hemogramă3.
Cauze de respingerea probei
– frotiuri nefixate în maxim 8 ore de la recoltare;
– frotiuri executate din sânge recoltat pe EDTA3.
Recipient de recoltare
a) se execută frotiuri de sânge capilar direct pe lame de microscopie;
b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogramă3.
Cantitate recoltată
a) 3-5 frotiuri;
b) 2 mL3.
Prelucrare necesară după recoltare
Este preferabil ca fixarea frotiurilor să se facă în primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face în primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 părţi + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometrează 30 secunde, după care frotiurile se spală cu jet de apă de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot păstra câteva zile la temperatura camerei, până la colorare3.
Stabilitate probă
– frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;
– frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.
Metoda – examinare microscopică3.
Interpretarea rezultatelor
In monocite, activitatea enzimatică a ANAE se evidenţiază prin apariţia unui compus roşu-brun, cu aspect difuz, moderat sau intens colorat (tip M – monocitar). In celulele T (inclusiv limfoblaştii T) şi megacarioblaşti, aspectul este mai mult focal, în regiunea Golgi sau paranuclear. Aspectul colorării este util, într-o anumită măsură, în diferenţierea tipurilor de celule.
Etapa de inhibare cu NaF a fost adaugată pentru a face esteraza nespecifică „mai specifică”. Activitatea enzimei în celulele liniei monocitare este inhibată de NaF, în timp ce în restul celulelor activitatea persistă.
Alfa-naftil acetat esteraza este obişnuit negativă în celulele de serie granulocitară. Celulele blastice din LAM-M0, M1 şi M2 sunt de obicei negative. In LAM–M3 esteraza nespecifică este pozitivă în 20-30% din cazuri, fiind mai slabă ca intensitate decat în monocite; reacţia este sensibilă la inhibare cu NaF în aproximativ 1/3-1/2 din cazurile pozitive.
Celulele blastice monocitare din LAM-M4 au activitate ANAE intens pozitivă, difuză (tip M) în proporţie de peste 20%, iar în cele din LAM-M5 în proporţie de peste 80%, sensibilă la NaF.
Megacarioblaştii leucemici din LAM-M7 au pozitivitate focală distinctă parţial inhibată de NaF. Eritroblaştii din LAM-M6 au de obicei activitate ANAE pozitivă, neinhibată de NaF.
Celulele blastice din LAL sunt negative; foarte rar pot apărea celule ANAE slab pozitive cu aspect granular, cu sensibilitate variabilă la NaF1;4.
Bibliografie
1. Dan Coliţa. Tratat de Medicină Internă-Hematologie, partea a II-a (sub redacţia Radu Păun), ed. 1999, 1014-1026.
2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.
5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.
6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.
