Informații generale – Citochimie PAS
Citochimia se bazează pe studiul microscopic al componenţilor chimici celulari: nucleoproteine, proteine, hidraţi de carbon, lipide şi enzime.
Coloraţiile citochimice oferă informaţii în legătură cu linia celulară şi diferenţierea celulelor hematopoietice şi joacă un rol important în evaluarea anomaliilor hematologice, în special în diagnosticul diferenţial şi clasificarea bolilor maligne ale sângelui.
Un principiu de care trebuie ţinut seama este faptul că, o reacţie pozitivă este întotdeauna valoroasă, în timp ce reacţia negativă este neconcludentă. Pentru certitudine, în majoritate cazurilor reacţiile citochimice se practică cu un martor pozitiv al reacţiei1;2.
|
Reacţii citochimice
|
LAM – M1,M2
|
LAM – M3
|
LAM – M4
|
LAM – M5
|
LAM –M6
|
LAM – M7
|
LAL
|
|
MPO
|
+
|
++
|
+
|
– , +/-
|
–
|
–
|
–
|
|
PAS
|
– , +/-
|
– , +
|
– , +/-
|
– , +
|
+
|
+
|
– , + , ++
|
|
ANAE
|
–
|
– , +
|
+
|
++
|
+
|
+ |
– , +/-
|
– negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.
Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB şi LAL necesită coroborarea datelor de microscopie optică – morfologie şi coloraţii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronică.
Informaţii generale
In celulele sangvine reacţia pozitivă este datorată, în primul rând, prezenţei de glicogen citoplasmatic. Acumularea de glicogen se consideră a fi un indicator al dereglării metabolismului acestuia.
Multe din celulele sangvine prezintă o reacţie PAS pozitivă în citoplasmă. Intensitatea acestei reacţii şi tipul de colorare variază cu tipul celular1.
Principiul reacţiei
Reactivul Schiff este o soluţie incoloră obţinută prin reducerea fucsinei bazice. Acidul periodic oxidează grupul glicol sau derivaţii săi. Rezultatul este producerea de aldehide care reacţionează cu reactivul Schiff pentru a produce o culoare purpurie1;3.
Recomandări pentru determinarea PAS
– diagnosticul leucemiei acute limfoblastice (LAL) subtipurile L1 şi L2;
– diagnosticul de sindrom mielodisplazic ori LAM-M6 prin evidenţierea eritroblaştilor PAS-pozitivi;
– diferenţierea celulelor Gaucher şi a histiocitelor cu granule „albastre ca marea” de alte tipuri de macrofage1.
Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)3.
Specimen recoltat
a) sânge capilar şi/sau aspirat medular – frotiuri
b) se recomandă recoltarea simultană de sânge venos pentru hemogramă3.
Cauze de respingerea probei
– frotiuri nefixate în maxim 8 ore de la recoltare;
– frotiuri executate din sânge recoltat pe EDTA3.
Recipient de recoltare
a) se execută frotiuri de sânge capilar direct pe lame de microscopie;
b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogramă3.
Cantitate recoltată
a) 3-5 frotiuri;
b) 2 mL3.
Prelucrare necesară după recoltare
Este preferabil ca fixarea frotiurilor să se facă în primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face în primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 părţi + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometrează 30 secunde, după care frotiurile se spală cu jet de apă de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot păstra câteva zile la temperatura camerei, până la colorare3.
Stabilitate probă
– frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;
– frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.
Metoda – examinare microscopică3.
Interpretarea rezultatelor
Glicogenul apare colorat în roşu purpuriu, sub forma de granule sau difuz.
Martorul pozitiv al reacţiei este reprezentat de granulocitul matur.
Granulocitele conţin glicogen sub formă difuză începând cu stadiul de promielocit unde apare roz şi creşte pe măsura maturaţiei. Bazofilele sunt moderat-intens PAS pozitive, frecvent prezentând grămezi amorfe în jurul nucleului. In leucemia acută mieloblastică (LAM) pot exista mieloblaşti care prezintă granule roşii, mici sau medii. In faza blastică a leucemiei granulocitare cronice (LGC) blaştii sunt frecvent PAS pozitivi, similar limfoblaştilor din leucemia acută limfoblastică. Promielocitele din leucemia acută promielocitară (LAM-M3), în special forma hipergranulară, sunt de obicei PAS pozitive.
In mod normal, un număr mic (mai puţin de 15%) de limfocite mature pot fi PAS pozitive cu următoarele aspecte :
1+ rare granule roşii, mici sau medii;
2+ număr moderat granule roşii, mici sau medii;
3+ inele de granule roşii, grosolane sau grămezi de material amorf de culoare roşie în citoplasmă sau acoperind nucleul.
In leucemia limfatică cronică (LLC) netratată şi fază leucemică a limfoamelor, numărul de celule limfoide pozitive este de obicei crescut în mod semnificativ, dar acest rezultat nu este concludent.
In leucemia acută limfoblastică (LAL) un număr variabil de limfoblaşti pot fi PAS pozitivi 1+,2+,3+. Aspectul PAS pozitiv 3+ prezintă specificitate înaltă pentru limfoblaştii leucemici. Limfoblaştii sunt caracterizaţi printr-o mare variabilitate a activităţii glicogenice: sunt PAS pozitivi doar în ~ 50% din cazurile de LAL-L1 şi L2, în timp ce în LAL-L3 sunt constant negativi.
Creşterea glicogenului în limfocitele patologice nu este specifică leucemiei, ci se datorează creşterii activităţii metabolice care are loc în cursul oricărui tip de proliferare limfoidă1.
Monocitele sunt negative sau slab pozitive(1+). Precursorii monocitelor în leucemia acută monocitară (LAM-M5) sunt frecvent pozitivi şi pot prezenta granule mari sau grămezi amorfe, similar limfoblastilor leucemici, dar de obicei limitate la citoplasmă. In leucemia acută mielomonocitară (LAM-M4) blaştii, când sunt PAS pozitivi, prezintă un aspect fin granular.
Precursorii eritroizi normali sunt PAS negativi. Proeritroblaştii şi eritroblaştii bazofili din eritroleucemie (LAM-M6) pot prezenta un aspect granular, cu granule grosolane dispuse în jurul nucleului. Un aspect difuz PAS pozitiv, poate fi prezent în eritroblaştii maturi din LAM-M6 şi sindromul mielodisplazic (SMD).
Megacarioblaştii, megacariocitele şi plachetele sunt PAS pozitive. Megacarioblaştii din LAM-M7 prezintă un aspect difuz sau cu granule dispuse periferic1;4;5.
Limite şi interferenţe
Reacţia PAS are valoare mică în diferenţierea LAL de alte tipuri de LA cu diagnostic dificil şi incert, datorită heterogenităţii limfoblaştilor1.
Bibliografie
1. Dan Coliţa. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redacţia Radu Paun), ed. 1999, 1014-1026.
2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.
5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.
6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.
