Anticoagulant lupic

Informaţii generale şi recomandări pentru determinarea anticoagulantului lupic

Anticoagulanţii de tip lupic sunt anticorpi îndreptaţi împotriva complexelor fosfolipide-proteine. Aceştia interferă in vitro cu testele de coagulare dependente de fosfolipide, determinând prelungirea lor (cel mai frecvent folosit fiind timpul de tromboplastină parţială activat aPTT)^1;2.

In vivo, prezenţa anticogulanţilor de tip lupic se asociază cu un risc crescut de evenimente trombotice (trombofilie)³. Prevalenţa trombozelor la pacienţii cu anticoagulanţi lupici este de 24-36%; predomină trombozele profunde ale membrelor şi embolismul pulmonar. Pacientele cu avorturi spontane recurente prezintă anticoagulanţi lupici în aproximativ 10% din cazuri.

Datorită heterogenităţii intrinseci a anticoagulanţilor lupici diagnosticul de laborator este adesea dificil. Testele folosite trebuie să fie capabile să distingă  anticorpii cu activitate de lupus anticoagulant de anticorpii anti-factori de coagulare, deficitul de factori şi heparină, deoarece toate aceste patru condiţii pot cauza prelungirea testului aPTT. În practică, plasmele cu deficit de factori de coagulare sunt uşor de identificat, deoarece adăugarea plasmei normale normalizează in vitro timpul de coagulare. Cu toate acestea, testul aPTT izolat nu poate diferenţia cu certitudine plasmele care conţin anticoagulanţi lupici de cele care conţin anticorpi anti-factori de coagulare şi/sau heparină³.

În 2009 Societatea Internaţională de Hemostază şi Tromboză a revizuit şi modificat recomandările privind detectarea anticoagulantului lupic (LA). Astfel, s-au îmbunătăţit criteriile de selectare a pacienţilor la care se indică această investigaţie şi de asemenea a fost elaborat un algoritm de testare în laborator.

Selectarea pacienţilor

Testarea pentru detectarea LA trebuie să fie limitată la pacienţii care au o probabilitate semnificativă de a avea sindrom antifosfolipidic (APS) sau care prezintă o prelungire neexplicată a aPTT la un control de rutină.

Trombozele venoase profunde neprovocate sau trombozele arteriale fără explicaţie apărute la pacienţi tineri (<50 ani), trombozele cu localizare neobişnuită, pierderile de sarcină survenite tardiv, orice episod trombotic sau complicaţie a sarcinii la persoane având boli autoimune (lupus eritematos sistemic, artrită reumatoidă, trombocitopenie autoimună, anemie hemolitică autoimună) indică o probabilitate mare de APS; subiecţii asimptomatici depistaţi întâmplător cu aPTT prelungit, pacientele cu avorturi spontane recurente survenite precoce în sarcină şi persoanele tinere cu tromboze venoase profunde provocate au o probabilitate medie de APS, în timp ce trombozele venoase profunde sau tromboembolismul arterial survenite la vârstnici se asociază cu probabilitate redusă de APS.

Algoritmul de testare în laborator pentru detectarea LA optimă

1. recoltarea probei: se recomandă ca recoltarea probelor să fie efectuată înaintea iniţierii tratamentului anticoagulant sau la suficient timp după întreruperea acestuia; sângele va fi recoltat pe citrat de sodiu 0.105M (1/9); proba va fi dublu centrifugată; dacă testul nu se efectuează imediat, plasma separată va fi rapid congelată; înaintea efectuării testului proba va fi decongelată prin imersia completă într-o baie de apă la 37°C timp de 5 minute.
2. alegerea testelor: se recomandă efectuarea a două teste screening bazate pe principii diferite (testul cu venin de viperă Russel diluat = dRVVT – testul cel mai robust pentru detectarea LA) şi un test aPTT ce foloseşte silica ca activator şi are un conţinut scăzut de fosfolipide (al doilea test ca sensibilitate după
3. amestecul plasmă normală + plasmă de pacient („mixing test”): se efectuează un amestec 1:1 de plasmă normală + plasmă de pacient, fără preincubare, timp de 30 minute; plasma normală poate fi obţinută in house de la donatori sănătoşi sau se poate utiliza plasmă comercială liofilizată sau congelată; rezultatul testului este sugestiv pentru LA dacă timpul de coagulare al amestecului de plasmă este mai mare decât valoarea cut-off stabilită pentru plasma normală; amestecul corectează timpii de coagulare în cazul deficitului de factorii plasmatici; ideal se va efectua şi un timp de trombină pentru a identifica prezenţa heparinei şi inhibitorilor specifici ai factorilor coagulării; testul nu va putea fi efectuat dacă plasma este incoagulabilă.
4. testele de confirmare – utilizează reactivi cu un conţinut ridicat de fosfolipide (fosfolipide în bistrat sau în fază hexagonală); se testează proba pacientului cu reactivul ce are concentraţie ridicată de fosfolipide (confirmare) şi se compară rezultatul obţinut cu cel de la etapa de screening (în prezenţa unui reactiv cu un conţinut scăzut în fosfolipide); se calculează corecţia procentuală [(screen – confirm) / screen] x 100, fie raportul LA (screen/confirm) şi se interpretează în raport cu valorile cut-off stabilite pentru plasma normală.
5. raportarea rezultatelor – se va face cantitativ cu un comentariu care să indice dacă rezultatele sunt compatibile cu un rezultat pozitiv sau negativ⁴.

În 2014 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) a elaborat primul său ghid privind testarea LA. Între recomandările CLSI și cele ale ISTH există o concordanță în ceea ce privește faza preanalitică, utilizarea dRVVT în algoritmul de diagnostic, calcularea dependenței de fosfolipide și modul de interpretare a rezultatelor.

Principala diferență este legată de faptul că CLSI recomandă o nouă ordine de efectuare a testelor – screening, confirmare, „mixing test” – acest lucru fiind explicat de faptul că „mixing test” poate conduce în unele situații la rezultate fals-negative, prin introducerea unui factor de diluție ce ar omite detecția unor anticogulanți mai slabi. CLSI menționează de asemenea că în cazurile clare de rezultate pozitive la testele de screening și confirmare și în absența altor cauze de alungire a timpilor de coagulare depistate la screening-ul de rutină, recurgerea la „mixing test” nu este necesară.

Pe de altă parte, testul de amestec al plasmei de pacient cu plasmă normală este foarte util atunci când se obține un rezultat pozitiv la testele de screening și negativ la cele de confirmare, pentru a permite detectarea LA în prezența unei anomalii de coagulare asociate precum și a unor anticoagulanți suficienți de potenți pentru a induce un grad de rezistență la efectul de neutralizare al reactivului de confirmare.

În această ultimă situație factorul de diluție introdus de „mixing test” este avantajos deoarece poate reduce efectul de rezistență al anticoagulantului și facilita astfel contracararea acestuia de către reactivul de confirmare. Atunci când este suspectată o anomalie de coagulare coexistentă efectuarea testelor de screening și a celor de confirmare pe un amestec de 1:1 al plasmei de pacient cu plasma normală poate releva prezența LA⁵.

Pregătire pacient – ideal, proba trebuie să fie recoltată înaintea iniţierii tratamentului anticoagulant³.

Specimen recoltat – sânge venos³.

Recipient de recoltă – vacutainer cu citrat Na 0.105 M (1/9), capac bleu/verde³.

Cantitate recoltată – cât permite vacuumul³.

Cauze de respingere a probei – probă în cantitate inadecvată (sub nivelul indicat pe vacutainer); specimen hemolizat; prezenţă de coaguli în probă³.

Prelucrare necesară după recoltare – centrifugare 15 min la 2500 g pentru obţinerea plasmei (plasma trebuie să fie foarte săracă în trombocite, T <10000/μL – dublă centrifugare), urmată imediat de separarea plasmei şi congelarea acesteia; probele recoltate în afara laboratorului vor fi transportate în recipientul destinat probelor congelate^1;3.

Stabilitate probă – plasma separată este stabilă 4 ore la temperatura camerei;1 lună la -20°C³.

Metode

Laboratorul Snevo a adoptat recomandarea CLSI 2014 de a efectua testele de detectare a LA în ordinea screening, confirmare, „mixing test”, acesta din urmă efectuându-se opțional, în funcție de particularitatea cazului analizat.

Screening: dRVVT screen + aPTT-LA (aPTT sensibil pentru LA); dacă rezultatul este negativ la ambele teste, LA va fi comunicat negativ; dacă se obţine un rezultat pozitiv la unul sau ambele teste se va recurge la testele de confirmare.

Confirmare: dacă aPTT-LA este pozitiv se va efectua testul de neutralizare cu fosfolipide în fază hexagonală; dacă dRVVT screen este pozitiv se va efectua dRVVT confirm³.

Valori de referinţă – anticoagulant lupic negativ³.

Menţiune: Pentru diagnosticul de sindrom antifosfolipidic sunt semnificative 2 rezultate pozitive obţinute la interval de 12 săptămâni^3;4.

Limite şi interferenţe

Rezultatele obţinute pe probe recoltate în cursul unui episod trombotic acut trebuie interpretate cu prudenţă deoarece pacienţii se află sub tratament anticoagulant de atac, iar reactanţii de fază acută (de exemplu, FVIII) pot înregistra valori crescute⁴. La pacienţii aflaţi în tratament cu preparate de heparină cu greutate moleculară mică (LMWH) testul se poate efectua numai din probele recoltate la 12 ore de la ultima doză administrată. Dacă testul trebuie efectuat la pacienţi sub anticoagulante orale se recomandă întreruperea acestora şi administrarea de LMWH^4;5, deoarece antagoniştii de vitamină K pot induce rezultate fals-pozitive⁶.

Nivelurile de heparină >1 UI/mL pot produce interferenţe (valori fals pozitive), nivelurile mai mici fiind contracarate de substanţele neutralizante conţinute în reactivi³.

De asemenea, dabigatranul (inhibitor de trombină) precum şi inhibitorii direcţi de factor Xa (rivaroxaban sau apixaban) pot determina valori fals pozitive pentru anticoagulantul lupic, de aceea nu se recomandă testarea la pacienţii aflaţi în tratament cu aceste anticoagulante⁶.

Bibliografie

1. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Lupus Anticoagulant Comprehensive. www.labcorp.com 2016. Ref Type: Internet Communication
2. Lothar Thomas. Haemostasis. In Clinical Laboratory Diagnostics, 1998, 636-638.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2016. Ref Type: Catalog.
4. V. Pengo, A. Tripodi, G. Reber, J.H. Rand,  T.L. Ortel, M. Galli, P.G. de Groot. Official Communication of the SSC: Update of the Guidelines for Lupus Anticoagulant Detection. In Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2009, 7: 1737-1740.
5. Moore GW. Recent Guidelines and Recommendations for Laboratory Detection of Lupus Anticoagulants. Semin ThrombHemost 2014 Mar;40(2):163-71.
6. Funk DM. Coagulation assays and anticoagulant monitoring. American Society of Hematology. 2012.