ARN viral SARS-COV-2 si Influenza A/B

Test diagnostic COVID-19 și Influeza A/B 

Testul RT PCR multiplex este disponibil pentru recoltare în centrele Synevo dedicate și se efecutează doar în baza unei programări online. Mai multe detalii aici.

Testul ARN viral SARS-CoV-2 și Influenza A/B (RT PCR multiplex) este primul test combinat care depistează 3 tipuri de virusuri: SARS-CoV-2,  Influenza A (gripa A) și Influenza B (gripa B). Astfel, Testul RT PCR multiplex permite detectarea simultană și diferențierea virusurilor care determină boli respiratorii, precum COVID-19, gripa A sau grupa B.

Infecțiile tractului respirator sunt cele mai frecvente afecțiuni ale sezonului rece. În Europa gripa apare cu regularitate în epidemii anuale, în lunile de iarnă, iar anul acesta este diferit, deoarece sezonului gripal i s-a alăturat și o infectie virala cu manifestari asemenatoare, COVID-19.

Virusurile cu tropism respirator cauzează afecțiuni acute locale și/sau sistemice, cele mai grave cazuri înregistrându-se în rândul vârstnicilor, al pacienților imunocompromiși și al copiilor. Tabloul clinic poate include tuse, rinoree și congestie nazală, febră, cefalee și mialgie. Din cauza similarității manifestarilor clinice determinate de diverse infectii virale, diagnosticarea exclusiv pe baza simptomelor clinice este dificilă. Conceptul de testare multiplex permite detectarea simultană, în cadrul aceluiași test, a agenților patogeni cel mai frecvent implicați în etiologia bolilor respiratorii. Identificarea posibililor factori declanșatori oferă date care permit medicului să stabilească tratamentul corespunzător pentru pacient și oferă autorităților publice posibilitatea de a lua măsurile necesare pentru controlul bolii.

Testul SARS-CoV-2 & Influenza A/B – detectie ARN viral, acreditat internațional în SUA de Administraţia americană pentru Alimente şi Medicamente (FDA) și introdus pentru prima dată pe piața medicală din România în septembrie 2020 are acuratețe crescuta și vine în ajutorul profesioniştilor din domeniul sănătăţii care pot diagnostica pacienții corect şi rapid, în vederea administrării celui mai potrivit tratament.

Influenza A și B (Virusul gripal A/B) sunt virusuri ARN din familia Orthomyxoviridae. Pe parcursul epidemiilor anuale de influenza, 5–20% din populație este afectată de infecțiile tractului respirator, cu instalarea rapidă a febrei.¹ Tipul predominant de virus influenza diferă adesea ca urmare a derivațiilor și mutațiilor antigenice.² Virusurile Influenza A pot fi subtipate in baza glicoproteinelor de suprafata: hemaglutinina (H) și neuraminidaza (N); subtipurile de influenza A H1N1 și H3N2 fiind tulpinile cel mai frecvent întâlnite la om. Subtipului H3N2 este asociat cu o forma severa de boala și o creștere a mortalității.² Pe parcursul sezonului gripal 2009–2010, Influenza A (H1N1) (H1- 2009, cunoscută și drept „gripa porcină”) a devenit principalul tip de virus influenza în circulație, răspunzător pentru aproximativ 99% dintre infecțiile raportate și, de atunci, a înlocuit tulpinile de H1N1 anterioare anului 2009.³ În prezent, sunt disponibile mai multe medicamente pentru tratamentul infectiilor virale cu Influenza, insa eficacitatea specifică tipului și rezistența la medicație sunt afectate de apariția de noi tulpini ale virusului.⁴ Complicațiile precum pneumonia virală sau bacteriană cresc rata mortalității asociată infecțiilor cu virusul influenza.⁵

Virusul SARS-CoV-2, denumit inițial 2019-nCoV a fost descoperit în decembrie 2019 în Wuhan, provincia Hubei din China, apoi secvențiat și izolat în ianuarie 2020. Aparține genului Betacoronavirus, subgenul Sarbecovirus si este responsabil de pandemia actuală de pneumonie atipică⁶.

Din punct de vedere clinic, virusul SARS-CoV-2 determină o infecție respiratorie denumită COVID-19 (Coronavirus infectious disease – 2019). Timpul dintre expunerea inițială la virus și debutul simptomelor (perioada de incubație) este de 2-14 zile în 95% din cazuri, cu o medie de 5-6 zile, ceea ce indică că este necesară o perioadă de carantină de minum 14 zile a contacților⁷.

Boala este caracterizată prin simptomatologie predominant respiratorie: febră, tuse seacă, dispnee de severitate variabilă si poate evolua către pneumonie bilaterală interstițială, insuficiență respiratorie sau detresă respiratorie acută (ARDS) care este principala cauză de mortalitate. Persoanele cu vârstă peste 60 de ani, precum și cele cu comorbidități (cum ar fi, hipertensiune arterială, diabet zaharat, boală cronică de rinichi) prezintă un risc mai mare de boală severă. Există și cazuri cu manifestări gastrointenstinale (mai ales diaree), iar la unii pacienți (în special la cei tineri) au fost semnalate hipo/anosmie (pierderea mirosului) și hipo/disgeuzie (pierderea gustului) ca simptome precoce⁸. Fiziopatologia ARDS indus de SARS-CoV-2 este similară cu cea a pneumoniei comunitare severe cauzată de alte virusuri sau bacterii. Producția excesivă de citokine proinflamatorii (factorul de necroză tumorală alfa, interleukin 6 și interleukina 1 beta), descrisă ca o “furtună de citokine” se asociază cu un risc crescut de hiperpermeabilitate vasculară și insuficiență multiplă de organ, cu o rată mare de mortalitate⁹.

Specimen recoltat – Exsudat nazofaringian (ENF) recoltat conform procedurilor standard, in recipient cu mediu de transport¹⁰

Recoltarea exsudatului nazo faringian:

Exsudat nazofaringian – Solicitați pacientului să tușească pentru a mobiliza secrețiile către faringele posterior. Inclinați spre spate capul pacientului într-un unghi de aproximativ 70 de grade. Tamponul se introduce cu grijă în narină si se coboară pe planșeul inferior al acesteia până când se ajunge în nazofarinx. Tamponul se răsucește de 2-3 ori, după care se extrage ușor. Acesta va fi imersat în recipientul cu mediu de transport și se închide capacul etanș. În timpul acestei operațiuni pacientul poate simți o anumită presiune sau discomfort¹⁰.

Stabilitate proba – eșantioanele trebuie procesate și testate cât mai repede. Daca acest lucru nu este posibil, proba este stabila refrigerata (2 – 8°C) 3 zile¹⁰.

Probele vor fi etichetate corespunzător si vor fi insotite de Formularul de însoțire probe recoltate de la cazul suspect de COVID-19^10,11.

Metodă – RT – PCR multiplex¹⁰.

Testul utilizează amplificarea selectivă a două secvențe țintă ale genomului viral SARS-CoV-2: o secvență localizată în regiunea ORF1a specifică pentru SARS-COV-2 si o secvență conservată din gena E comună subgenului Sarbecovirus.

Pentru virusurile gripale A și B, amplificarea selectivă a acizilor nucleici din eșantion se realizează prin utilizarea unor primeri specifici pentru secventa ce codifica proteinele matriceale 1 și 2 (M1/M2) pentru virusul Influenza A și secventa ce codifica proteina de export nuclear (NEP) si proteina nonstructurala 1 (NS1) pentru virusul Influenza B.

Pentru monitorizarea extracției și amplificării se adaugă în fiecare probă analizată un control ARN intern, reprezentat de o secvență necompetitivă care nu prezintă omologie cu genomul viral¹⁰.

Interpretarea rezultatelor:

Un rezultat nedetectabil (negativ) indică absența în proba analizată a ARN-ului SARS-COV-2 si /sau ARN viral Influenza A sau B. Cu toate acestea, un rezultat negativ nu exclude posibilitatea unei infecții virale deoarece rata de detecţie depinde de modul de recoltare a probei, cantitatea de acizi nucleici din probă (niveluri ale organismelor în eșantion care sunt sub limita de detecție a testului), prezenţa inhibitorilor sau stadiul infecţiei. De asemenea, rezultatul testelor poate fi afectat de tratamentul antiviral administrat inainte de testare.

Rezultatele negative nu trebuie utilizate ca bază unică de diagnosticare sau tratament, ci trebuie corelate cu datele clinice si epidemiologice.

Un rezultat pozitiv indică prezența în proba analizată a ARN-ului SARS-COV-2 si /sau ARN viral Influenza A sau B fiind sugestiv pentru diagnosticul COVID-19 si/sau gripa.

Un rezultat echivoc arata ca nu s-a obtinut amplificare pentru tinta specifica SARS-COV-2, Orf1/a, ci SARS-COV-2, Orf1/a, ci doar pentru regiunea pan-Sarbecovirus. Posibil interferenta cu alte Sarbecovirusuri sau prezenta tintei la limita inferioara de detectie a metodei. Se recomanda repetarea testarii printr-o alta metoda RT-PCR.

Un rezultat repetat invalid (absența amplificării controlului intern), determinat cel mai probabil de o inhibiție a reacției RT-PCR, impune repetarea testului pe o nouă probă¹⁰.

Limitarile metodei:

Detectarea acizilor nucleici virali este influențată de recoltarea adecvată a eșantioanelor, de manipularea, transportul și pregătirea acestora. Nerespectarea procedurilor corecte pentru oricare dintre acești pași poate determina rezultate incorecte. Există un risc de rezultate fals pozitive sau fals negative ca urmare a recoltării, transportării sau manipulării incorecte a eșantioanelor.

Administrarea vaccinurilor nazale anti-influenza (de ex., FluMist) anterior recoltării eșantionului ENF ar putea determina un rezultat pozitiv.

Bibliografie

1. World Health Organization. WHO Fact Sheet No. 221, April, 2009. Influenza (Seasonal).
2. Bammer, L., Fukuda, A., Klimov, and N. Cox. in VPD Surveillence Manual (2002).
3. Update: influenza activity – United States, August 30, 2009-March 27, 2010, and composition of the 2010-11 influenza vaccine. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 59, 423–430 (2010).
4. Bammer, L., Fukuda, A., Klimov, and N. Cox. in VPD Surveillence Manual (2002).
5. Morens, D. M., Taubenberger, J. K. & Fauci, A. S. Predominant role of bacterial pneumonia as a cause of death in pandemic influenza: implications for pandemic influenza preparedness. J Infect Dis 198, 962–70 (2008).
6. Walls AC, Park YJ, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell. 2020 Apr 16;181(2):281-292.e6.
7. Linton NM, Kobayashi T, Yang Y, Hayashi K, Akhmetzhanov AR, Jung SM, Yuan B, Kinoshita R, Nishiura H. Incubation Period and Other Epidemiological Characteristics of 2019 Novel Coronavirus Infections with Right Truncation: A Statistical Analysis of Publicly Available Case Data. J Clin Med. 2020 Feb 17;9(2).
8. Comisia de Microbiologie Medicală a Ministerului Sănătății. Comisia de Microbiologie Medicală a Colegiului Medicilor din România. Infecția cu SARS-CoV-2. Ref Type: Internet Communication http://www.ms.ro/wp-content/uploads/2020/04/Recomandarea-Comisiilor-de-Microbiologie- Medical%C4%83-a-MS-%C8%99i-CMR-Diagnostic-SARS-CoV-2.pdf
9. Jose RJ, Manuel A. COVID-19 Cytokine Storm: The Interplay Between Inflammation and Coagulation. Lancet Respir Med. 2020 Apr 27;S2213-2600(20)30216-2
10. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2020. Ref Type: Catalog
11. Metodologia de supraveghere a sindromului respirator acut cu noul coronavirus (COVID-19), Actualizare 28.04.2020. Ref Type: Internet Communication. http://www.cnscbt.ro/index.php/info-medical/1596-metodologia-de-supraveghere-a-covid-19-actualizare-27-03-2020/file