Electroforeza proteinelor serice cu imunofixare

Informaţii generale – Electroforeza proteinelor serice cu imunofixare

În mod clasic, detectarea şi identificarea gamopatiilor monoclonale se face prin electroforeza proteinelor cu imunofixare (IFE) care combină separarea electroforetică în gel de agaroză a proteinelor cu imunoprecipitarea, folosind antiseruri monospecifice faţă de lanţurile grele şi uşoare individuale. Astfel, se obţin rezultate rapide, uşor de interpretat. În timp ce apariţia componentelor policlonale se datorează activităţii mai multor tipuri de clone de limfocite B, gamapatiile monoclonale rezultă ca urmare a proliferării unei singure clone celulare B.

Electroforeza capilară constituie o metoda alternativă pentru caracterizarea gamopatiilor monoclonale (imunotipizare). Fiecare probă este amestecată cu antiseruri individuale care sunt specifice lanţurilor grele gama (Ig G), alfa (Ig A) şi miu (Ig M), respectiv lanţurilor uşoare kapa (libere şi legate) şi lambda (libere şi legate). Proteinele, separate în capilare de cuarţ sunt detectate direct prin absorbanţă la 200 nm. Electroforegramele sunt evaluate vizual pentru detectarea prezenţei reacţiilor specifice cu presupusele proteine monoclonale.

În laboratoarele Synevo sunt utilizate ambele metode electroforetice automatizate¹.

Recomandări pentru efectuarea IFE – evaluarea componentelor monoclonale depistate la electroforeza proteinelor serice; evaluarea amiloidozei, a bolilor limfoproliferative, colagenozelor, a condiţiilor asociate cu deficit imun sau disgamaglobulinemii^2;3.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial¹.

Specimen recoltat – a) sânge venos¹; b) urina din 24 ore¹.

Recipient de recoltare – a) vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator²; b) eprubetă pentru urină¹.

Prelucrare necesară după recoltare¹

Se separă serul prin centrifugare.

a) Pentru electroforeza proteinelor serice în gel de agaroză cu imunofixare, în funcţie de procentul benzii care apare la electroforeza proteinelor serice în domeniul γ, sau mai rar β, se fac anumite diluţii din probele de ser, şi anume:

b) În cazul electroforezei capilare a proteinelor serice cu imunotipizare, pentru fiecare probă de analizat şi în funcţie de concentraţia imunoglobulinelor totale, se va selecta programul de diluţie care se va aplica automat de către analizor :

• ” HYPERGAMMA ” dacă nivelul imunoglobulinelor totale este > 2 g/dL (hipergamaglobulinemie),
• ” HYPOGAMMA ” dacă nivelul imunoglobulinelor totale este < 0,8 g/dL (hipogamaglobulinemie),
• ” STANDARD ” dacă nivelul imunoglobulinelor totale este cuprins între 0,8 şi 2 g/dL (program de diluţie implicit).

c) Urina se pipetează ca atare, după ce în prealabil se concentrează în dispozitive speciale. Pentru caracterizarea lanţurilor uşoare se utilizaează numai electroforeza în gel de agaroză cu imunofixare.

Volum probă – a) min. 1 mL ser; b) un eşantion de 10 mL¹.

Cauze de respingere a probei – ser hemolizat¹.

Stabilitatea probei – a) serul separat este stabil maxim 4 zile la temperatura camerei şi 2 săptămâni la 2-8°C²; b) urina este stabilă 1 lună la 2-8°C¹.

Principiul metodei

a) electroforeza proteinelor serice/urinare în gel de agaroză cu imunofixare se bazează pe vizualizarea pe gel a benzilor corespunzătoare proteinelor specifice, prin formarea complexului antigen-anticorp, după separarea fracţiilor prin electroforeză.

Stripurile de IFE sunt din gel agar şi au şase “picioruşe”: primul este alocat proteinelor totale care se separă în urma migrării electroforetice, celelalte sunt tratate cu antiseruri care se leagă specific de imunoglobulinele umane IgG, IgA, IgM – lanţuri grele, şi k, λ – lanţuri uşoare.

b) electroforeza capilară a proteinelor serice cu imunotipizare se bazează pe separea moleculelor proteice încarcate electric în funcţie de mobilitatea electroforetică proprie într-o soluţie tampon alcalină. Separarea se produce de asemenea şi în funcţie de pH-ul soluţiei electrolitice şi de fluxul electroosmotic. Sistemul electroforetic este alcătuit din 8 tuburi capilare care funcţionează în paralel. În acest sistem se prepară o probă diluată care este injectată simultan prin aspirare în şase capilare la capătul anodic. Pentru imunotipizare, tiparul de referinţă (tipar ELP) este obţinut prin injectarea probei amestecate cu soluţie EL în capilarul nr. 1, din aceasta rezultând un tipar electroforetic complet al proteinelor din probă. Tiparele de antiser sunt obţinute prin injectarea în capilarele nr. 2 – 6 a probelor anterior diluate şi amestecate cu antiseruri specifice lanţurilor grele gama (Ig G), alfa (Ig A), miu (Ig M) şi lanţurilor uşoare libere şi legate kapa şi lambda. Apoi are loc o separare a proteinelor la tensiune înaltă, iar detectarea directă a proteinelor se efectuează la 200 nm la capătul catodic al capilarului. Capilarele sunt imediat spălate cu o soluţie de spălare şi pregătite pentru următoarea analiză cu soluţia tampon. Suprapunerea tiparelor de antiser cu tiparul ELP permite vizualizarea dispariţiei şi/sau a scăderii fracţiei monoclonale pe tiparul antiserului, aceasta indicând o gamopatie¹.

Valori de referinţă şi citirea rezultatelor

Probele de ser/ urină normale nu conţin componentă monoclonală.

a) electroforeza proteinelor serice/urinare în gel de agaroză cu imunofixare

• Un component monoclonal produce pe gel o bandă distinctă îngustă – tipic unei gamapatii monoclonale – în timp ce imunoglobulinele policlonale formează o “zonă” difuză de precipitare cu antiserurile specifice.
• În cazul gamapatiilor oligoclonale se obţin cel puţin trei benzi înguste (o bandă discretă corespunzătoare unui lanţ greu şi două benzi corespunzătoare ambelor tipuri de lanţuri uşoare)⁵.

Se compară locaţia benzilor imunofixate cu banda de referinţă de pe “picioruşul” corespunzător proteinelor totale, putând fi identificată proteina specifică.

b) electroforeza capilară a proteinelor serice cu imunotipizare

La sfârşitul analizei, fiecare tipar de antiser (Ig G, Ig A, Ig M, Kapa şi Lambda) este automat suprapus peste tiparul ELP. Dacă o componentă monoclonală şi un antiser specific au reacţionat unul cu celălalt, fracţia corespunzătoare dispare de pe tiparul antiserului. Analiza probei de ser diluată în diluantul segmentului de antiser este efectuată în timpul imunotipizării şi asigură tiparul electroforetic al proteinelor probei netratate (tiparul “Ref”) ce permite verificarea concordanţei dintre analiza proteinelor şi imunotipizare. Aceste comparaţii fac posibilă identificarea şi caracterizarea componentelor monoclonale.

Tiparul proteinei netratate (tiparul “Ref”) nu este suprapus şi nici nu poate fi suprapus pe niciun tipar de antiser al imunotipizării¹.

• O probă de ser normală sau o probă cu hipergamaglobulinemie arată dispariţia imunoglobulinelor policlonale pe tiparele de antiser (vizualizată ca o scădere a fracţiilor gama şi/sau beta) fără niciun efect asupra celorlalte fracţii proteice.
• Prezenţa unei proteine monoclonale (gamopatie monoclonală) este caracterizată prin dispariţia unei fracţii cu unul dintre antiserurile contra lanţurilor grele (gama, alfa sau miu) şi fie cu antiserul cu lanţ uşor anti-kapa, fie cu antiserul cu lanţ uşor anti-lambda. Vârful monoclonal detectat, de obicei ascuţit şi bine demarcat, trebuie să fie localizat la aceeaşi distanță de migrare ca şi fracţia monoclonală suspectată observată pe pista de referinţă (pista ELP).
• Absenţa reacţiei cu oricare dintre antiserurile anti-lanţ greu aplicate şi reacţia cu unul dintre antiserurile lanţurilor uşoare poate indica :
  • – o gamopatie cu lanţ uşor : se va confirma rezultatul cu antiseruri cu lanţ uşor liber anti-kapa sau anti-lambda la electroforeza în gel de agaroză.
  • – o gamopatie Ig D sau Ig E foarte rară.
• Dacă nu se observă o reacţie pozitivă cu oricare din antiserurile anti-lanţuri uşoare aplicate, în timp ce un antiser anti-lanţ greu reacţionează, aceasta poate indica o gamopatie foarte rară cu lanţ greu (gama, alfa sau miu).
• O gamopatie biclonală este caracterizată de dispariţia a două fracţii de lanţuri grele (identice sau diferite) şi a două fracţii de lanţuri uşoare (identice sau diferite).
• O gamopatie oligoclonală este caracterizată prin dispariţia unor vârfuri multiple, de obicei mici, sau de deflecţii cu unul sau mai multe tipuri de lanţuri grele şi cu cele două tipuri de lanţuri uşoare

Limita de detecţie a unei componente monoclonale este de aproximativ 25 mg/dL (la electroforeza capilară a proteinelor serice cu imunotipizare)¹.

Interpretarea clinică a rezultatelor

Prezenţa unei proteine monoclonale în ser sau urină sugerează de obicei un proces malign, deşi componente monoclonale pot să apară şi în diverse condiţii benigne sau chiar în absenţa unei modificări patologice (gamopatie monoclonală cu semnificaţie nedeterminată, care necesită monitorizare periodică pentru a verifica stabilitatea componentului monoclonal).

În mielomul multiplu, 99% din pacienţi prezintă o proteină monoclonală în ser sau urină.

Boala Waldenström se caracterizează prin prezenţa obligatorie în ser a unei proteine monoclonale de tip IgM.

La aproximativ 75% din pacienţii cu mielom multiplu sau boala Waldenström se depistează în urină un lanţ uşor monoclonal (proteina Bence-Jones).

În urina pacienţilor cu mielom multiplu sau amiloidoză se pot găsi atât fragmente de lanţuri grele cât şi lanţuri uşoare libere⁴.

În boala lanţurilor grele se obţine o bandă monoclonală în dreptul unui lanţ greu, fără a se constata o bandă corespunzătoare în dreptul unui lanţ uşor⁵.

Limite şi interferenţe

Acest test nu include antiseruri monospecifice pentru IgD şi IgE. În cazul suspiciunii clinice de mielom multiplu de tip IgD sau IgE se recomandă testul Imunofixare IgD, IgE.

Reacția antigen – anticorp este diferită între faza lichidă şi cea agaroză. Deoarece electroforeza capilară este efectuată integral într-un mediu lichid, unele antiseruri pot uneori reacţiona încrucişat cu componentele monoclonale prezente în probă. Această reacţie încrucişată care survine foarte rar poate duce la concluzia că este prezentă o gamopatie biclonală în locul unei gamopatii monoclonale reale. Recurgerea la electroforeza în gel de agaroză asigură elucidarea unor astfel de situaţii¹.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog
2. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Immunofixation (IFE), Serum and Protein Electrophoresis, Serum. www.labcorp.com . 2015. Ref Type: Internet Communication
3. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Immunofixation (IFE)   and    Protein Electrophoresis, 24H-Urine.. www.labcorp.com . 2015. Ref Type: Internet Communication.
4. Frances Fischbach. Immunodiagnostic Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009, 613-614.
5. Lothar Thomas. Monoclonal Immunoglobulins. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 746.