HLA-DR4/DR1 – Shared Epitope – poliartrita reumatoida

Informatii generale si recomandari – HLA-DR4/DR1 – Shared Epitope – poliartrita reumatoida

Asocierea  dintre polimorfismul specific HLA  si afectiunile reumatice este bine cunoscuta de multa vreme. Pana in  anii 1980 cele mai multe studii corelau prezenta specificitatilor serologice HLA cu polimorfismul genelor HLA. Studiile mai recente, utilizand  tehnici moleculare, au identificat gene specifice sau haplotipuri raspunzatoare de modificarile din bolile reumatice. Asocierea genetica este reflectata in termenul de „risc relativ”, care reprezinta raportul statistic intre riscul individual de boala la purtatorii unui marker genetic si riscul la indivizii aceleiasi populatii care nu au acest marker. Un risc relativ mai mare decat 1 indica o asociere pozitiva intre alela HLA si boala respectiva⁶.

Mecanismele prin care unele alele HLA conduc sau favorizeaza aparitia unei boli nu sunt complet elucidate. Dupa toate aparentele, nu exista un mecanism unic de producere a tuturor bolilor reumatice si, respectiv, autoimune prin intermediul HLA. Exista mai multe ipoteze in acest sens:

● Alele HLA de risc pentru o anumita boala se asociaza printr-un dezechilibru de linkaj cu adevarata mutatie care determina boala.

● Moleculele HLA corespunzatoare unor anumite alele actioneaza ca receptori pentru diferiti patogeni cu rol de trigger.

● Moleculele HLA corespunzatoare unor anumite alele au afinitate crescuta pentru peptide artritogene.

● Moleculele HLA corespunzatoare unor anumite alele au asemanari structurale cu molecule ale agentilor patogeni, ceea ce conduce la reactii incrucisate.

● Anumite alele HLA influenteaza raspunsul imun la diferite antigene, inclusiv autoantigene.

● Anumite haplotipuri HLA conservate in diferite populatii, probabil prin conferirea de avantaje de selectie, se asociaza mai frecvent cu aparitia de boli reumatice autoimune; este posibil ca aceste haplotipuri sa conserve mutatii multiple, favorizand aparitia bolii⁵.

Artrita reumatoida (AR) este asociata frecvent cu HLA-DR4. La caucazieni, de exemplu, alelele DR4 cel mai frecvent asociate cu AR sunt DRB1*0401 si  DRB1*0404, in timp ce la pacientii din Japonia, Israel si China predomina alela DRB1*0405.

Si alte specificitati serologice HLA-DR sunt asociate cu AR: DR1 a fost raportat la caucazieni si la pacienti proveniti din Japonia, Spania, Grecia, Israel; DR3 este intalnit in Kuweit, DR6 la indienii Yakima din America, DR9 in Chile si DR10 in Spania, Grecia si Israel.

Pentru a explica spectrul larg al diferitelor asocieri HLA-DR cu AR s-a presupus ca ar fi implicata o secventa peptidica inalt conservata, comuna mai multor alele HLA-DRB1 sau o varianta a acesteia, denumita „shared epitope” sau epitop comun, care confera predispozitia  fata de AR². Studiile au aratat ca alelele HLA-DRB1 asociate cu AR codifica  in pozitiile 70-74  ale regiunii hipervariabile 3 a lantului beta secventele de aminoacizi QKRAA (*0401), QRRAA (*0404, *0405, *0408, *0101, *0102) sau RRRAA (*1001). Aceste reziduuri de aminoacizi pot afecta legarea peptidelor antigenice si prezentarea acestora limfocitelor T (TCR)^2;3;4. La debutul raspunsului imun, rolul primar al moleculei de HLA este de a lega antigenul peptidic si de a-l prezenta receptorului celular al limfocitului T (TCR)¹. Regiunea din jurul pozitiei 70 este implicata in formarea “santului” care leaga catena laterala a peptidului antigenic si de asemenea interactioneaza direct cu TCR.

Conform acestui model structural care explica susceptibilitatea pentru PR, epitopul comun controleaza natura interactiunii trimoleculare intre TCR, peptidul antigenic si molecula HLA prin crearea unei potriviri intre elemente, care va conduce in final la activarea limfocitului T. Astfel, controlul se poate exercita prin influentarea secventei specifice a peptidului antigenic captat in “santul” moleculei HLA, a recunoasterii directe a complexului HLA-peptid antigenic de catre TCR sau a ambelor⁶.

Daca ar exista un peptid artritogen acesta s-ar lega preferential de epitopul comun. Totusi acesta nu a fost identificat pana in prezent. O explicatie alternativa implica un mimetism molecular intre epitopul comun si secventele antigenice ale patogenului care induce AR. In acest sens, a fost constata o omologie a secventelor intre epitop si o proteina de soc termic (HSP) provenita de la E. coli².

Recent un grup de cercetatori a reconsiderat ipoteza epitopului comun si a formulat o noua clasificare a alelelor HLA-DRB1 valabila pentru populatia caucaziana. Conform investigatiilor efectuate, riscul de dezvoltare AR depinde de localizarea secventei RAA in pozitiile 72-74 precum si de tipul aminoacizilor din pozitiile 71 si 70. Astfel, in cazul acestor alele RAA asocierea lizinei (K) in pozitia 71 confera cel mai mare risc, cea a argininei (R) un risc intermediar si cea a alaninei (A) sau a acidului glutamic (E) riscul cel mai scazut. Glutamina (Q) sau arginina (R) din pozitia 70 conduc la un risc mai mare decat acidul aspartic (D).

Tinand cont de aceste constatari alelele HLA-DRB1 pot fi clasificate in doua grupuri in functie de prezenta sau absenta secventei RAA in pozitiile 72-74, respectiv alelele S si X. Alelele S pot fi subimpartite in trei categorii in functie de tipul aminoacidului din pozitia 71: S₁ atunci cand este vorba de alanina sau acid glutamic (secvente A-RAA si E-RAA), S₂ in prezenta lizinei (secventa K-RAA) si S₃ atunci cand este prezenta arginina (secventa R-RAA). La randul lor alelele S₃ pot fi impartite in functie de tipul aminoacidului din pozitia 70 astfel: S_3D care codifica secventa D-R-RAA si S_3P care codifica secventele Q-R-RAA sau R-R-RAA. Deoarece alele S₂ pot avea aminoacizii Q sau D in pozitia 70 rezulta secventele D-K-RAA si Q-K-RAA (vezi tabelul).

Tabel: Clasificarea alelelor HLA-DRB1

Studiul efectuat a dus la urmatoarele constatari:

-alelele S₁, S_3D si X sunt asociate cu risc scazut (denumite din acest motiv alele L);

-prin combinarea alelelor mentionate rezulta urmatoarele 6 genotipuri, prezentate in ordinea descrescatoare a riscului relativ de dezvoltare a AR: S₂/S_3P (risc relativ 22.2), S₂/S₂ (risc relativ 20.5), S_3P/S_3P (risc relativ 8.2), S₂/L (risc relativ 5.9), S_3P/L (risc relativ 4) si genotipul L/L (de referinta).

Aceasta clasificare a alelelor HLA-DRB1 ar putea contribui la descifrarea componentei genetice a AR daca diferentele semnificative dintre genotipuri vor fi corelate cu mecanisme fiziopatologice distincte. Studii recente au indicat ca asocierea epitop comun-AR este limitata la AR cu anticorpi anti-CCP pozitivi.

In concluzie, evidentierea epitopului comun este asociata cu un risc crescut de dezvoltare a AR si poate ajuta diagnosticul in faza precoce a bolii. Prezenta unui “shared epitope” este mai ales un marker prognostic pentru evolutia si severitatea bolii, deoarece progresia rapida si severa a eroziunii articulare  se coreleaza cu statusul HLA-DRB1 si tipul epitopului. A fost demonstrat si un efect de doza-gena: pacientii care au 2 alele ce codifica un epitop comun prezinta o evolutie mai severa decat pacientii purtatori ai unei singure alele sau a nici uneia. In special epitopii comuni  de pe alelele DR4 sunt predictivi pentru o forma progresiva si distructiva de boala, cu manifestari extraarticulare. Genotipul HLA-DRB1*0401/0401 este asociat cu sindromul Felty.

Referitor la terapia medicamentoasa, s-a demonstrat ca pacientii homozigoti pentru DR4-shared epitope sau pacientii cu 2 alele ce codifica un epitop comun raspund mai bine la etanercept (sau la alti agenti biologici) decat la metotrexat.

Testul efectuat in laboratorul nostru permite:

-tipajul alelelor HLA-DRB1: DRB1*01 (DR1), DRB1*04 (DR4) si DRB1*1001, printr-o tehnica de rezolutie joasa;

-diferentierea alelelor HLA-DRB1*01 si DRB1*04 in alele pozitive sau negative pentru “shared epitope”, printr-o tehnica de inalta rezolutie;

-tipajul secventelor de aminoacizi din “shared epitope”: QKRAA, QRRAA sau RRRAA;

-precizarea statusului heterozigot sau homozigot pentru “shared epitope”⁴.

Recomandari pentru efectuarea testului

– identificarea si diferentierea cazurilor clinic incerte de AR;

– stabilirea prognosticului bolii la pacientii diagnosticati cu AR;

– identificarea pacientilor cu risc de a dezvolta AR pentru ca la aparitia manifestarilor clinice sa se intervina terapeutic precoce si agresiv (alegerea/optimizarea terapiei)⁴.

Pregatire pacient – nu este necesara o pregatire speciala⁴.

Specimen recoltat – sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁴.

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul⁴.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate; probe refrigerate sau congelate⁴.

Stabilitate proba – 7 zile la 2-8ºC⁴.

Metoda – reactie de polimerizare in lant (PCR) urmata de analiza produsilor de amplificare prin revers-hibridizare pentru detectarea epitopului comun QKRAA/QRRAA/RRRAA⁴.

Valori de referinta si interpretarea rezultatelor

Epitop comun QKRAA/QRRAA/RRRAA: Negativ.

In cazul unui rezultat pozitiv se va comunica daca este vorba de o singura alela sau de 2 alele care codifica un epitop comun; se va preciza de asemenea tipul alelelor HLA-DRB1⁴.

Bibliografie

1. Jean Roudier. HLA-DRB1 genes and extraarticular rheumatoid arthritis. In Arthritis Research & Therapy 2006, 8:103.

2. Julio C. Delgado, Edmond J. Yunis. The Major Histocompatibility Complex and Disease. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 2007, 900-901.

3. Laëtitia Michou, Pascal Croiseau, Elisabeth Petit-Teixeira, Sophie Tezenas du Montcel, Isabelle Lemaire, Céline Pierlot, José Osorio, Wafa Frigui, Sandra Lasbleiz, Patrick Quillet, Thomas Bardin, Bernard Prum, Françoise Clerget-Darpoux, François Cornélis and the European Consortium on Rheumatoid Arthritis Families. Validation of the reshaped shared epitope HLA-DRB1 classification in rheumatoid arthritis. In Arthritis Research & Therapy 2006, 8:R79.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2018. Ref Type: Catalog.

5. Mihai Bojinca. Aspecte genetice in boli reumatice. In Esentialul in Reumatologie. Editura Amaltea, 2007,

6. Ravinder N Maini, Nathan J Zvaifle. Rheumatoid artritis and other synovial disorders-section 5- r.1998 Ed.Mosby.