HPV (Papiloma Virus Uman) E6/E7 ARNm

Informatii generale si recomandari

Cancerul de col uterin se dezvolta ca urmare a unei infectii persistente, necontrolate de catre sistemul imun al gazdei, cu un tip HPV (papiloma virus uman) oncogen, in special tipurile 16 si 18 care sunt responsabile de > 70% din cazuri.

Proteinele E6 si E7 produse de tipurile HPV cu risc crescut detin un rol esential in carcinogeneza fiind exprimate atat in leziunile cervicale pre-maligne cat si in cele avansate. Genele E6 si E7 se afla sub controlul proteinei codificata de gena E2. Un eveniment crucial pentru transformarea maligna este integrarea ADN circular HPV in genomul gazdei. Integrarea se produce adesea la nivelul genei E2 care este astfel inactivata; ca urmare a acestui proces rezulta o expresie necontrolata a genelor E6 si E7.

Oncoproteinele E6 si E7 perturba ciclul celular prin legarea si inactivarea a doua proteine ale gazdei cu rol important in reglarea diviziunii celulare normale: proteina supresoare tumorala p53 si proteina retinoblastomului pRb. Astfel, legarea proteinei E6 de p53 induce degradarea rapida a acestei proteine supresoare tumorale printr-un proces dependent de ubiquitina⁴. De asemenea interactioneaza cu proteina pro-apoptotica Bax si determina  rezistenta la apoptoza alaturi de o instabilitate cromozomiala crescuta.

In plus, oncoproteina E6 activeaza telomeraza si are drept rezultat imortalizarea celulelor infectate. E7 are drept tinta  un alt supresor tumoral –pRb – pe care il inactiveaza prin alterarea starii de fosforilare.  In mod normal, pRb se leaga de factorul de transcriptie E2F,care are rol in progresia ciclului celular din faza G1 in faza S in urma interactiunii cu cicline si cu kinaze dependente de cicline.In prezenta E7 rezulta un complex E7-pRb inactiv care perturba atasarea  E2F la pRb si permite ca E2F sa se lege de ADN si sa induca cresterea si proliferarea celulara.

Proteinele E6 si E7 ale diferitelor tipuri HPV exercita un efect variabil in cursul procesului de transformare maligna: cele provenite de la HPV 16 si HPV 18 au un potential oncogen ridicat, pe cand cele produse de HPV 6 si HPV 11 sunt incapabile sa lege si sa inactiveze p53 si pRb.

Integrarea materialului genetic viral in genomul gazdei este insotita de alterarea morfologiei epiteliului scuamos cervical, de la leziuni intraepiteliale cu risc scazut la cele cu risc crescut, caracterizate prin atipii citologice si indice mitotic anormal. Integrarea genomului viral se produce in cromozomi diferiti, insa, de regula, in regiunile care contin gene importante pentru viabilitatea celulara. Nu este necesara integrarea intregului genom viral, dar cea a genelor E6 si E7 este critica pentru carcinogeneza.

Celulele care contin genom viral integrat prezinta un avantaj de crestere fata de celulele normale, ceea ce conduce la proliferare celulara si pierderea proprietatii de diferentiere. De asemenea, integrarea intrerupe ciclul de viata al virusului astfel ca nu se mai produc virioni completi (infectie neproductiva). Desi integrarea reprezinta sfarsitul biologic al virusului, aceasta faciliteaza expresia perpetua a oncogenelor virale.

De obicei, in cazul leziunilor intraepiteliale cu risc scazut (LSIL) nu se constata integrarea ADN-ului HPV, spre deosebire de HSIL in care materialul genetic viral este frecvent integrat in genomul gazdei. Integrarea confera infectiei HPV un caracter ireversibil. In absenta tratamentului, un numar semnificativ de HSIL evolueaza catre cancer cervical, desi acest proces poate sa dureze ani de zile sau chiar decade.

Intr-un procent de pana la 25% din cazurile de cancer cervical induse de HPV 16 se constata prezenta unui ADN viral extracromozomial (epizomal) neintegrat, in timp ce carcinoamele asociate cu HPV 18, 31 si 35 contin aproape intotdeauna ADN-HPV integrat. In cancerele cu HPV epizomal

s-a demonstrat existenta unor mutatii YY1; elementele YY1 constituie situsurile de reglare pentru factorul de transcriptie YY1 care controleaza activitatea unui numar mare de gene. Mutatiile YY1 impiedica legarea factorului de transcriptie si faciliteaza expresia oncogenelor E6/E7 cu accelerarea  ciclului celular si proliferare celulara anormala⁵.

Deoarece HPV nu poate fi cultivat s-au dezvoltat teste care se bazeaza pe detectia acizilor nucleici virali in tesuturile infectate. Majoritatea testelor depisteaza ADN-ul viral prin diverse tehnici de amplificare confirmand astfel prezenta infectiei la nivelul celulelor cervicale. Cu toate acestea, testele bazate pe ADN (cum ar fi testul de detectie a tipurilor cu risc crescut sau cel de genotipare HPV) prezinta o limitare importanta prin faptul ca majoritatea infectiilor HPV au un caracter tranzitoriu iar valoarea predictiva pozitiva a unui rezultat ADN-HPV pentru dezvoltarea leziunilor cervicale cu risc crescut este destul de scazuta.

Pentru a pune in evidenta activitatea oncogena HPV au aparut teste care se bazeaza pe detectarea ARN-ului mesager pentru proteinele E6/E7 initial din 5 tipuri HPV cu risc crescut (16, 18, 31, 33, 45)  si apoi din 14 tipuri HPV oncogene: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 si 68.

ARNm E6/E7 traduce activitatea virala directa si corespunde initierii si mentinerii leziunilor pre-canceroase; astfel testele bazate pe ARN au valoare predictiva superioara testelor ADN in ceea ce priveste riscul pentru dezvoltarea cancerului cervical.

S-a constatat ca nivelurile ARNm E6/E7 inregistreaza cresteri proportionale cu severitatea leziunilor, astfel ca detectia produsului de transcriptie ar avea o valoare prognostica mai mare si ar putea imbunatati specificitatea si valoarea predictiva pozitiva a ADN-HPV in screening.

Intr-un studiu norvegian 3% din femeile peste 30 ani testate au fost pozitive pentru  ARNm E6/E7 iar pentru persoanele cu citologie normala sau modificarile de tip LSIL s-au obtinut  mult mai putine rezultate pozitive la testul pentru ARNm decat la detectia HPV-ADN tipuri oncogene. Valoarea prognostica a acestui test a fost evaluata de asemenea intr-un studiu de urmarire, pe o perioada de 2 ani, a 77 paciente cu citologie ASC-US (“celule scuamoase anormale de semnificatie nedeterminata”) sau LSIL; femeile care au obtinut rezultate pozitive la  testul ARNm au avut o probabilitate de 70 ori mai mare de a fi diagnosticate cu neoplazie cervicala intraepiteliala CIN 2+confirmata histologic decat femeile cu rezultate negative.

Mai mult, testul ARNm a prezentat o sensibilitate clinica pentru CIN 2+ similara cu cea a testelor PCR de detectie ADN-HPV dar o specificitate clinica mai mare, ceea ce sugereaza ca testele bazate pe ARNm ar putea imbunatati triajul pacientelor cu citologie echivoca sau cu risc scazut.

Intr-un studiu care a inclus femei sub 30 ani, rata de pozitivitate pentru ARNm E6/E7 a fost de 14.5% in comparatie cu cea de 32.5% si 20.8% pentru ADN-detectie tipuri oncogene si respectiv genotipare HPV. Obtinerea unui numar mai mic de rezultate pozitive la testul ARNm se traduce practic intr-un numar mai redus de paciente care trebuie urmarite; totusi nu au putut fi formulate concluzii in legatura cu specificitatea clinica a testului la aceasta grupa de varsta datorita lipsei datelor histologice.

Totusi, testul ARNm ar putea prezenta valoare  in cazul femeilor sub 30 ani, mai ales ca la aceste persoane nu se recomanda testarea ADN-HPV datorita prevalentei foarte mari a infectiilor tranzitorii.

Tot intr-un studiu norvegian ARNm E6/E7 a fost pozitiv in 89% din carcinoamele scuamoase ale colului si in 77% din leziunile cu risc crescut (CIN 2/3). CIN 2+ a fost detectat la 83% din femeile cu citologie normala si ARNm pozitiv. Nu a fost calculata valoarea predictiva a testului in acest studiu, insa se pare ca specificitatea clinica a ARNm este mai buna fata de cea a ADN-HPV. S-a raportat ca un singur rezultat ARNm pozitiv are valoare predictiva mai buna pentru infectia persistenta decat testul ADN¹.

Ca o concluzie, detectia calitativa a produsului de transcriptie E6-E7 pentru tipurile HPV cu risc crescut poate sa evalueze specific riscul de progresie si de transformare maligna in special la femeile cu citologie ASC-US sau LSIL, precum si  la cele cu citologie normala si ADN-HPV pozitiv. 60-80% din numeroasele infectii HPV sunt tranzitorii, fiind eliminate spontan, in medie, in decurs de 1 an, ceea ce face ca testul ARNm sa fie mai specific decat detectia ADN-ului viral. Scopul este deci depistarea infectiilor active si potential persistente².

Pregatire paciente – se va evita recoltarea probei in perioada menstruala.

De asemenea, 48 ore inainte de prelevarea probei, pacientele vor evita:

• raporturile sexuale;
• efectuarea dusurilor vaginale;
• folosirea tampoanelor intravaginale, contraceptivelor locale, a diverselor geluri, creme si tratamente vaginale³.

Specimen recoltat – celule cervicale colectate in mediu lichid; recoltarea va fi efectuata cu ajutorul periutei cervicale Cervex-Brush³.

Stabilitate proba – probele de celule cervicale colectate in mediul PreservCyt sunt stabile cel putin 1 saptamana la 2-8ºC³.

Metoda – TMA (amplificare mediata de transcriptie). Testul identifica calitativ productia oncoproteinelor E6 si E7 (factor primar in carcinogeneza) si nu virionii HPV pentru 14 tipuri HPV cu risc crescut: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 si 68³.

Valori de referinta – HPV E6/E7 ARNm nedetectabil³.

Limita de detectie

Pentru tipurile HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 56, 58, 59, 66 si 68: 100 copii/reactie.

Pentru HPV 52: 300 copii/reactie³.

Interpretarea rezultatelor

Un rezultat pozitiv pentru HPV E6/E7 ARNm are un alt impact clinic decat cel pentru HPV-ADN in sensul ca indica un potential crescut de transformare maligna a epiteliului scuamos cervical³.

Limite si interferente

In cazul unui rezultat pozitiv testul nu specifica care din cele 14 genotipuri HPV este asociat produsului de transcriptie identificat.

Testul nu a fost validat pentru urmatoarele categorii de paciente:

• care au primit vaccin anti-HPV;
• care au suferit tratament excizional sau ablativ pentru o leziune cervicala cu risc crescut sau cancer cervical;
• cu histerectomie;
• imunodeprimate³.

Bibliografie

1. Agnes Kathrine Lie, MD, PhD. Human papillomavirus E6/E7 mRNA testing as a predictive marker for cervical carcinoma. In Expert Rev Mol Diagn. 2008; 8(4):405-415.

2. Joseph Monsonego. Traité des infections et pathologies génitales à papillomavirus. Springer-Verlach France, Paris, 2007, 57-58.

3. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2006. Ref Type: Catalog

4. Mike F. Janicek, MD and Hervy E. Averette, MD. Cervical Cancer: Prevention, Diagnosis, and Therapeutics. In CA Cancer J Clin 2001; 51:92.

5. Richard Mac DeMay. Human Papilloma Virus. In The Pap Test, ASCP Press, 2005, 83-85.