Profil ANA extins-Blot (U1-nRNP, SS-A, Ro-52, SS-B, Scl-70, Pm-Scl, Jo-1, Centromer B, PCNA, ADN dublu catenar, Nucleozomi, Histone, Proteina P ribozomal, AMA M2, DFS70)

Informații generale – Profil ANA extins-Blot (U1-nRNP, SS-A, Ro-52, SS-B, Scl-70, Pm-Scl, Jo-1, Centromer B, PCNA, ADN dublu catenar, Nucleozomi, Histone, Proteina P ribozomal, AMA M2, DFS70)

Bolile autoimune reumatice sistemice (engl. systemic autoimmune rheumatic diseases, SARD) se caracterizează prin prezența în titruri crescute a autoanticorpilor față de proteine intracelulare și acizi nucleici. Acești autoanticorpi sunt denumiți generic anticorpi antinucleari (ANA) datorită faptului sunt îndreptați predominant împotriva antigenelor nucleare, dar ei includ și anticorpi anticitoplasmatici.

Detectarea ANA are o mare sensibilitate, de aceea este considerat cel mai bun test de screening pentru SARD. Prevalența ANA în aceste afecțiuni se situează între 20 și 100%. Pentru identificarea bolilor reumatismale este foarte importantă diferențierea ANA^1;2;3. Astfel, sunt descrise în prezent două categorii principale de anticorpi antinucleari:

1. Autoanticorpi ce au drept țintă antigenică ADN-ul și histonele;
2. Autoanticorpi ce au drept țintă antigene nucleare solubile (extractable nuclear antigens = ENA).

Varietatea autoantigenelor țintă ale anticorpilor anti-nucleari este extrem de mare de aceea în prezența unui rezultat pozitiv la examenul prin imunofluorescență indirectă este necesară detectarea de anticorpi specifici care să orienteze diagnosticul către o anumită boală autoimună. Utilizarea tehnicii imunoblot prezintă avantajul testării unor profile extinse de autoanticorpi, cum este și cazul celui efectuat în laboratorul nostru care permite diferențierea ANA față de 16 antigene⁴.

Anticorpii anti-U1nRNP și Sm sunt indreptați împotriva unor antigene care aparțin grupului de ribonucleoproteine mici (snRNP). Acestea sunt complexe formate din ARN cu un conținut înalt de uridină (U-RNA) și diverse proteine având o greutate moleculară de 9-70 kDa. Prin cromatografie au fost puse în evidență 5 tipuri de U-RNA: U1, U2, U4, U5 și U6. Particulele de U-nRNP conțin 6 proteine core sau Sm (B, B’, D, E, F, G), iar U1-RNP conține în plus proteine specifice (70K, A, C). Astfel, anticorpii anti – U1 RNP reacționează cu una sau mai multe proteine specifice în timp ce anticorpii anti-Sm reacționează cu una sau mai multe proteine core. Acțiunea snRNP este esențială pentru eliminarea intronilor din pre-ARN-ul mesager (procesul de splicing), rezultând ARNm care va fi exportat din nucleu și implicat în procesul de translație de la nivelul ribozomilor.

Titruri crescute de anticorpi anti-U1 RNP se întâlnesc cu o prevalență de 95-100% în boala mixtă de țesut conjunctiv (sindromul Sharp), constituind unul din criteriile de diagnostic al acestei afecțiuni. Titrul de anticorpi se corelează de asemenea cu gradul de activitate a bolii. Anticorpii anti-U1 RNP mai pot fi întâlniți și la pacienti cu LES (15-40%), scleroză sistemică și polimiozită^1;7.

Anticorpii anti-Sm sunt îndreptați asupra antigenului Sm, denumit astfel după primul pacient (Stephanie Smith) la care a fost pus în evidență. Antigenul Sm face parte din grupul snRNP implicate în procesul de splicing al ARN-ului mesager. Anticorpii anti-Sm sunt întâlniți la 5-40% din pacienții cu LES având o specificitate înaltă (peste 90%) pentru boala lupică. Împreună cu anticorpii anti-ADN dublu catenari pot fi considerați patognomonici pentru această condiție clinică și fac parte din criteriile ACR de diagnostic al LES⁶.

Anticorpii anti-SS-A (Ro) sunt îndreptați împotriva unui antigen care face parte tot din grupul snRNP – soluble substance A sau Robert antigen. Acesta este compus dintr-o moleculă ARN (Y1, Y2, Y3, Y4 sau Y5) și o proteină de 60 kDa. Complexul poate asocia și o proteină de 52 kDa (Ro52), dar acest lucru este încă controversat în literatura de specialitate. Diverse studii au arătat că serurile pozitive pentru SS-A conțin întotdeauna anticorpi împotriva proteinei native SS-A de 60 kDa și adițional pot avea și anticorpi îndreptați împotriva proteinei Ro52. Diferențierea de anticorpii anti-Ro52 are importanță diagnostică, deoarece aceștia sunt nespecifici, putând fi detectați într-o multitudine de afecțiuni.

Anticorpii anti-SS-A sunt asociați cu diverse boli autoimune: sindrom Sjögren (40-95% din cazuri), LES (20-60%), ciroză biliară primitivă (20%). Trebuie menționat că acești autoanticorpi apar în 100% din cazurile de lupus neonatal. Pot fi întâlniți de asemenea în hepatitele autoimune sau virale.

Anticorpii anti-SS-B (La) sunt îndreptați împotriva unei proteine ce deține un rol în transcripția ARN polimerazei III – soluble substance B sau Lane antigen. La om reprezintă probabil un factor de finalizare a transcripției care se leagă de capătul 3′ al produșilor de transcripție nou-generați ai ARN polimerazei III. Anticorpii anti-SS-B apar de obicei împreună cu anti-SS-A, fiind asociați cu aceleași condiții clinice^1;3;4.

Anti-Ro52 sunt îndreptați împotriva unui antigen de 52 kDa și au fost descriși ca autoanticorpi nespecifici asociați atât cu boli reumatice cât și non-reumatice. Sunt prezenți într-un procent de 100% la mamele feților sau nou-născuților cu bloc atrio-ventricular congenital sau lupus neonatal¹.

Anticorpii anti-Scl-70 sunt îndreptați împotriva unei proteine non-histonice de 70 kDa, izolată inițial din nuclei de celule hepatice provenite de la șobolan. Ulterior, s-a demonstrat că această proteină este un produs de degradare al ADN topoizomerazei I, o clasă de enzime localizate în nucleoplasmă și nucleoli, având funcția de a menține integritatea informațională a ADN (prin capacitatea de a scinda și de a reuni la loc unul din cele două lanțuri ADN).

Anticorpii anti-Scl-70 se găsesc la 40% din pacienții cu scleroză sistemică forma difuză și la 10% din pacienții cu scleroză sistemică forma limitată, fiind un element de prognostic nefavorabil^1;3;4;5.

Anticorpii anti PM-Scl sunt îndreptați împotriva proteinelor complexului nucleolar PM-Scl, compus din 11-16 polipeptide în care componentele antigenice au greutăți moleculare cuprinse între 20 kDa și 110 kDa. Principalele antigene sunt 2 polipeptide de 75 și respectiv 100 kDa, cunoscute ca PM-Scl 75 și PM-Scl 100. Cele 2 antigene sunt independente unul de celălat și nu reacționează încrucișat. Acest complex de proteine este implicat în biosinteza ribozomilor. Anticorpii anti-PM-Scl se asociază frecvent cu sindroamele overlap sclerodermie-polimiozită/dermatomiozită.

Anticorpii anti-Jo-1 sunt îndreptați împotriva enzimei histidil-t-ARN sintetaza. In vitro acești autoanticorpi se leagă de epitopii conformaționali ai enzimei și îi inhibă activitatea catalitică. Antigenul este sub formă dimerică și este localizat în citoplasmă; masa moleculară a subunităților este 50 kDa. Anticorpii anti-Jo-1 constituie un marker serologic pentru dermatomiozită/polimiozită, având o prevalență de 20-40%. Prezența acestor autoanticorpi se asociază cu o formă mai severă de boală, cu un prognostic rezervat și recăderi mai frecvente. Autoanticorpii pot fi detectați precoce, uneori precedând debutul simptomelor.

Anticorpii anti-CENP B sunt îndreptați împotriva unei proteine de 80 kDa localizată în zona de ancorare a fibrelor fusului mitotic în cursul mitozei. Toate serurile care conțin anticorpi anti-centromer reacționează cu CENP-B. Anticorpii anti-CENP B constituie un marker serologic pentru sindromul CREST, un subtip de scleroză sistemică (prevalență 70-90%). Pot apărea și la pacienții cu ciroză biliară primitivă.

Anticorpii anti-PCNA (proliferating cell nuclear antigen) sunt îndreptați împotriva unei proteine de 36 kDa ce constituie un cofactor al ADN polimerazei și participă astfel la procesul de replicare și reparare a ADN-ului. Acest antigen se mai numește și ciclina I, având un rol și în reglarea ciclului celular. Aspectul în imunofluorescența indirectă este variabil (granular/pătat), jumătate din nucleii celulelor în interfază având o intensitate scăzută. Anti-PCNA sunt detectați la 3% din pacientii cu SLE^1;4.

Anticorpii anti-ADN dublu catenar reacționează cu principalii epitopi ai acidului dezoxiribonucleic (ADN) nativ, dublu spiralat. Acești anticorpi reprezintă un marker de înaltă specificitate pentru LES, fiind prezenți la aproximativ 60% (30-90%) dintre pacienții cu boală lupică. Constituie de asemenea un instrument de monitorizare a evoluției clinice a acestei boli, deoarece nivelele serice de anticorpi anti-ADN se corelează cu gradul de activitate a bolii (în special pentru nefrita lupică). Se mai pot asocia într-un procent redus cu lupusul indus medicamentos, artrita reumatoidă și scleroza sistemică^1;7.

Anticorpii anti-nucleozomi

Nucleoproteinele (cromatina) sunt compuse din 40% ADN, 40% histone și 20% proteine non-histonice. Histonele sunt organizate de-a lungul ADN-ului în unități repetitive numite nucleozomi. Fiecare nucleozom este alcătuit dintr-un miez ce conține 8 histone (2 din clasa H2A, 2 H2B, 2 H3 și 2 H4) și este înfășurat prin 2 rotații complete de o secvență ADN (165bp). Nucleozomii sunt legați între ei printr-un segment de ADN liber având forma unui șirag de mărgele. Această structură, menținută strîns de histona H1 ce leagă 2 nucleozomi vecini, realizează o împachetare a ADN-ului de 10 ori. Anticorpii anti-nucleozomi reacționează cu partea expusă, adică cu ADN-ul din cromatină. Studiile clinice au demonstrat că acești anticorpi apar înaintea anticorpilor anti-ADN dublu catenar la pacienții cu LES⁸.

Anticorpii anti-histone reacționează împotriva histonelor ce constituie împreună cu ADN-ul componentele esențiale ale cromatinei nucleare. Histonele sunt alcătuite din proteine bogate în aminoacizii arginină și lizină, iar una din funcțiile lor importante este implicarea în organizarea structurală a cromatinei în nucleozomi .

Toate cele cinci clase de histone (H1, H2A, H2B, H3, H4) ca și complexele ADN-histone pot fi țintă pentru producerea de autoanticorpi. Anticorpii antihistone apar la aproximativ 95% dintre pacienții cu lupus eritematos indus medicamentos și reprezintă cel mai important criteriu de diagnostic. Cele mai frecvente medicamente implicate în apariția lupusului medicamentos sunt: procainamida, hidralazina, izoniazida, carbamazepina, penicilamina, clorpromazina, alfa metildopa, chinidina, salazosulfapiridina, minociclina. Anticorpii anti-histone pot persista ani după întreruperea medicamentului incriminat.

Anticorpii anti-histone pot să apară și în alte afecțiuni, cum ar fi LES și artrita reumatoidă^1;3;8.

Anticorpii anti-proteina P ribozomală sunt îndreptați împotriva a 3 fosfoproteine ribozomale: P0 (38 kDa), P1 (19 kDa) și P2 (17kDa). Acești anticorpi prezintă un patern citoplasmatic în imunofluorescența indirectă și constituie un marker pentru afectarea neuro-psihică în LES; nu se corelează cu activitatea bolii⁴.

Anticorpi anti-mitocondriali AMA M2 sunt îndreptați asupra subunității E2 a complexului piruvat dehidrogenazei (PDC-E2). Titrurile crescute vin în sprijinul diagnosticului de ciroză biliară primitivă (PBC) și pot avea valoare predictivă pentru dezvoltarea ulterioară de PBC la pacienți cu semne de colestază. Anti-M2 mai pot fi detectați în sindroame overlap ciroză biliară primitivă – hepatită autoimună (PBC-AIH), scleroza sistemică (6%) și sindromul Sjögren^1;5;9.

Anticorpi anti-DFS70 sunt îndreptați împotriva unui un co-activator al transcripției denumit DFS70 (engl. dense fine speckles 70 antigen, 70 kDa), p75 sau factorul de creștere derivat din epiteliul cristalinului (engl. lens epithelium-derived growth factor, LEDGF)¹⁰. Anticorpii anti-DFS70 au fost pentru prima dată identificați la un pacient cu cistită interstițială¹¹, ulterior fiind asociați cu diferite condiții patologice, cum ar fi dermatita atopică și cancerul de prostată1^2;13. Prevalența cea mai mare a anticorpilor anti DFS70 a fost raportată la pacienții cu sindrom Vogt-Harada (66.7%), tiroidită autoimună (55%), dermatită atopică (30%), în timp ce în SARD aceasta este semnificativ scăzută (≤ 2%)¹². Mai mult, nici unul dintre indivizii sănătoși cu anticorpi anti DFS70 pozitivi nu a dezvoltat SARD în decurs de 4 ani de la evaluarea inițială¹⁴.

În studiul condus de Watanabe et al, efectuat pe un lot de 597 voluntari sănătoși, au fost identificați anticorpii anti-DFS70 cu o prevalență de 11% în populația analizată și de 54% în cazul rezultatelor ANA pozitive. La examenul prin imunofluorescență indirectă pe substratul convențional Hep-2 anti-DFS70 au fost asociați cu un aspect granular/pătat fin dens, prezent atât în nuclei în interfază cât și în cromozomii din metafază¹⁵.

Având în vedere aceste date de prevalență, detecția izolată a anticorpilor anti DFS70 a fost propusă ca test de excludere a diagnosticului de SARD, inclusiv a lupusului eritematos systemic, la persoanele cu rezultat ANA pozitiv^14;15;16. De menționat că că peste 20% dintre indivizii sănătoși pot să prezinte un test ANA pozitiv, care nu pare să aibă legătură cu vârsta, ceea ce limitează relevanța diagnostică pentru SARD a autoanticorpilor ANA^17;18. Ce anume indică prezența anticorpilor antiDFS70 rămâne încă un fapt neelucidat. Recent, s-a formulat ipoteza conform căreia, în funcție de contextul în care sunt detectați, aceștia ar deține un rol protector sau dimpotrivă, unul patogenic, sau ar servi ca „senzori” pentru stresul oxidativ crescut¹⁹.

Recomandări pentru determinarea profilului ANA extins – BLOT – evaluarea pacienților cu testul ANA IIF (imunofluorescență indirectă) pozitiv și cu semne clinice sugestive de SARD. În general, nu se recomandă efectuarea ENA în prezența unui rezultat ANA IIF negativ decât dacă pacientul are semne clinice evidente de SARD și, în special, de sindrom Sjögren. Testul ANA poate fi uneori negativ în prezența unor anticorpi față de antigene foarte solubile, cum ar fi SS-A/Ro sau față de antigene citoplasmatice exprimate insuficient pe preparatele Hep-2 sau alte țesuturi, cum ar fi Jo-1².

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)⁹.

Specimen recoltat – sânge venos⁹.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator⁹.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare⁹.

Volum probă – minim 0.5 mL ser⁹.

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian⁹.

Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 4°C; timp mai îndelungat la -20 °C⁹.

Metodă – imunoblot. Testul utilizează 16 antigene native si recombinate purificate, care sunt fixate in cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

• nRNP/Sm: antigen nativ purificat
• Sm: antigen nativ purificat
• SS-A: antigen nativ purificat
• Ro 52: antigen recombinant
• SS-B: antigen nativ purificat
• Scl-70:antigen nativ purificat
• PM/Scl: antigen recombinant
• Jo-1: antigen nativ purificat
• CENP B:antigen recombinant
• PCNA:antigen recombinant
• ds DNA: antigen nativ purificat
• nucleozomi: antigen nativ
• histone: antigen nativ purificat
• proteina P-ribozomala: antigen nativ
• AMA-M2: antigen nativ purificat
• DFS70: antigen recombinant

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici aceștia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va atașa la porțiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluția de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecție enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacția enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip există o bandă de control intern. Apariția unei reacții de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect⁹.

Valori de referință și interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcție de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

Valori de referință:

• nRNP/Sm: negativ
• Sm: negativ
• SS-A: negativ
• Ro 52: negativ
• SS-B: negativ
• Scl-70: negativ
• PM/Scl: negativ
• Jo-1: negativ
• CENP B: negativ
• PCNA: negativ
• ds DNA: negativ
• nucleozomi: negativ
• histone: negativ
• proteina P-ribozomala: negativ
• AMA-M2: negativ
• DFS70: negativ⁹.

Bibliografie

1. Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.
2. Tozzoli R, Bizzaro N, Tonutti E, Villalta D, Bassetti D, Manoni F, Piazza A, Pradella M, Rizzotti P; Italian Society of Laboratory    Medicine Study Group on the Diagnosis of Autoimmune Diseases. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the  Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diseases. Am J Clin Pathol. 2002 Feb;117(2):316-24.
3. van Venrooij WJ, Charles P, Maini RN. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. J Immunol Methods. 1991 Jul 5;140(2):181-9.
4. Kumar Y, Bhatia A, Minz RW. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn Pathol. 2009 Jan 2;4:1.
5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com 2017. Ref Type: Internet Communication.
6. Soto ME, Vallejo M, Guillén F, Simón JA, Arena E, Reyes PA. Gender impact in systemic lupus erythematosus. Clin Exp Rheumatol. 2004 Nov-Dec;22(6):713-21.
7. Haugbro K, Nossent JC, Winkler T, Figenschau Y, Rekvig OP. Anti-dsDNA antibodies and disease classification in antinuclear antibody positive patients: the role of analytical diversity. Ann Rheum Dis. 2004 Apr;63(4):386-9.
8. EUROIMUN AG. Schlumberger W, et al. Diagnostic relevance of autoantibodies against nucleosomes. In Autoimmunity Reviews (2002), 32.
9. Laborator Synevo. Referințele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2017. Ref Type: Catalog.
10. Fritzler MJ. The antinuclear antibody test: last or lasting gasp? Arthritis Rheum 2011;63:19–22.
11. Ochs RL, Muro Y, Si Y, Ge H, Chan EK, Tan EM. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol 2000;105:1211–20.
12. Ganapathy V, Casiano CA. Autoimmunity to the nuclear autoantigen DFS70 (LEDGF): what exactly are the autoantibodies trying to tell us? Arthritis Rheum 2004;50:684–8.
13. Daniels T, Zhang J, Gutierrez I, Elliot ML, Yamada B, Heeb MJ, et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate 2005;62: 14–26.
14. Mariz HA, Sato EI, Barbosa SH, Rodrigues SH, Dellavance A, Andrade LE. Ana HEp-2 pattern is a critical parameter for discriminating ANA-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum 2010;63: 191–200.
15. Watanabe A, Kodera M, Sugiura K, Usuda T, Tan EM, Takasaki Y, et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum 2004;50:892–900.
16. Muro Y, Sugiura K, Morita Y, Tomita Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus 2008;17:171–6.
17. Op De BK, Vermeersch P, Verschueren P, Westhovens R, Marien G, Blockmans D, et al. Detection of antinuclear antibodies by indirect immunofluorescence and by solid phase assay. Autoimmun Rev 2011;10:801–8.
18. Pisetsky DS. Antinuclear antibodies in healthy people: the tip of autoimmunity’s iceberg? Arthritis Res Ther 2011;13:109.
19. Ochs RL, Mahler M, Basu A, Rios-Colon L, Sanchez TW, Andrade LE, Fritzler MJ, Casiano CA.). The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 2016 Aug;16(3):273-93.