Timidinkinaza

Informaţii generale – Timidinkinaza

Timidin kinaza este o enzimă citosolică cheie în calea de salvare a ADN-ului, catalizând transferul grupului fosfat terminal de la nivelul ATP la grupul 5`hidroxil al deoxitimidinei pentru a produce deoxitimidină monofosfat, care este apoi încorporată în ADN¹⁹. Sinteza de novo a timidinei monofosfat este în mod normal catalizată de timidilat sintetază din deoxiuridină monofosfat, în prezenţa acidului folic şi vitaminei B12. TK utilizează fie timidină exogenă din alimente, fie timidina endogenă eliberată prin degradarea unui substrat. Din acest motiv a fost desemnată ca o enzimă de salvare. TK este o enzimă implicată în sinteza acizilor nucleici şi, prin urmare, considerată un important marker de proliferare, în mod particular în celulele tumorale¹⁸.

Există două izoforme ale enzimei în celulele umane: TK1 – citosolică, găsită numai în celulele proliferante, producţia sa fiind restricţionată în faza S a ciclului celular asociată cu diviziunea celulară, şi TK2 – mitocondrială, independentă de fazele ciclului celular şi a cărei concentraţie nu este corelată cu proliferarea.

TK1 este forma predominantă în ser şi este un homodimer sau homotetramer alcătuit din subunităţi monomerice de 24kDa. TK1 poate fosforila analogi pirimidinici importanţi clinic, incluzând 5-fluoro-2`- dideoxitimidina şi 3`-azido-2`,3`-dideoxitimidina (AZT)¹⁹.

Nivelul TK în ser sau plasmă este atât de mic, încât măsurarea sa este bazată pe activitatea enzimatică, testele comerciale utilizând pentru aceasta analogi ai substratului. Determinarea TK în ser s-a făcut iniţial printr-o tehnică radioenzimatică (REA), dificultăţile tehnice şi folosirea radioactivităţii făcând ca acest test să nu fie larg acceptat. Mai recent au fost dezvoltate şi tehnici nonizotopice, cum ar fi CLIA care a demonstrat o corelaţie excelentă cu tehnologia standard REA. De asemenea metodele actuale permit determinarea activităţii enzimatice citosolice a TK, dar există şi metode care determină cantitatea, mai degrabă decât activitatea, TK în materialele biologice, precum şi metode imunohistochimice pentru TK^6;19.

TK a fost cel mai larg utilizată clinic între 1980 şi 2000, deoarece determinarea nivelurilor serice sau citosolice a continuat metodele de încorporare a TK pentru monitorizarea activităţii proliferative a ţesuturilor. În anii următori s-a înregistrat o reducere considerabilă a aplicaţiilor clinice ale TK în favoarea markerilor tumorali legaţi de tipul histologic al tumorii (CA19-9, CA15-3) sau markerilor cu specificitate de organ (PSA), iar markerii de proliferare au continuat să fie utilizaţi în special în hematologie. Aplicarea sa în practica clinică a revenit în jurul lui 2003 şi de atunci a fost folosită mai larg¹⁹.

TK reprezintă în prezent un marker tumoral secundar util în principal pentru determinarea naturii agresive a tumorii şi pentru monitorizarea anumitor cancere şi a terapiei. A fost arătat că nivelul seric al TK1 la pacienţi cu diferite forme de cancer se corelează cu stadiul clinic al bolii, iar măsurători repetate reflectă remisiuni şi recăderi^18;19.

În bolile hematologice, a căror caracteristică principală este proliferarea, TK îşi găseşte o aplicaţie largă.

▪ În leucemia limfatică cronică (CLL) prognosticul şi evoluţia clinică sunt heterogene. În timp ce unii pacienţi pot avea o speranţă de viaţă normală fără să necesite tratament, alţii pot deceda cu boală rezistentă la medicamente în doi ani de la prezentare. Datorită acestei variabilităţi, în ultimii ani mai mulţi parametri clinici şi hematologici au fost evaluaţi ca posibili indicatori ai prognosticului. Aceştia includ parametrii clinici (vârsta, sexul, indicele de performanţă), parametrii de laborator care reflectă încărcătura tumorală sau activitatea bolii (numărul de limfocite, nivelul LDH, pattern-ul infiltrării medulare, timpul de dublare a limfocitelor), iar mai recent au fost identificaţi o serie de parametri cu valoare prognostică mai mare, incluzând markeri serici (CD23 solubil, β₂-microglobulina sau TK), markeri genetici ai celulelor tumorale (aberaţii genomice, anomalii genice, statusul mutaţional al segmentelor variabile ale genei lanţului greu de imunoglobulină) sau markeri surogat ai acestor factori (CD38 şi ZAP-70)⁶.

Nivelul TK reflectă activitatea proliferativă a celulelor leucemice, corelându-se atât cu stadiul Ray/Binet cât şi cu statusul bolii, făcând distincţia între indolent şi agresiv, nivelele sale asociindu-se cu alte aspecte care arată încărcătura tumorală (gradul leucocitozei, limfocitozei, celularitatea medulară) şi cu alţi indicatori ai turn-over-ului celulelor tumorale (β₂-microglobulina, LDH)².

În plus studiile au arătat că TK are semnificaţie prognostică, astfel că poate fi un predictor independent al duratei intervalului fără progresie a bolii şi permite definirea CLL smoldering şi non-smoldering în stadiul Binet A^11;19.

Hallek et al. au studiat valoarea prognostică a TK la pacienţi netrataţi cu CLL stadiul Binet A. Din 22 parametri studiaţi numai 3 au furnizat informaţii prognostice independente asupra supravieţuirii fără progresie: TK >7.1 U/L, prezenţa limfadenopatiei şi un număr de leucocite >75000/μL. În plus TK adaugă informaţie prognostică independentă privind definirea CLL smoldering şi non-smoldering în stadiul Binet A. Astfel, separând pacienţii din grupul non-smolderig stadiul A în două subgrupuri pe baza valorii TK, cei cu un nivel al TK >7.1 U/L au avut o supravieţuire fără progresie mediană de 8 luni, faţă de pacienţii cu nivelul TK ≤ 7.1 U/L la care supravieţuirea fără progresie a fost mult mai lungă, de 49 luni, similară cu cea a pacienţilor smoldering (42 luni)¹⁹.

În studiul lor Raimondo et al. au arătat că TK este un indicator prognostic privind răspunsul la tratament şi supravieţuirea, astfel că 83% din pacienţii cu nivelul TK <10 U/L au răspuns la tratamentul cu fludarabină, faţă de 45% din pacienţii cu nivelul TK >10 U/L, iar rata supravieţuirii mediane a fost de 65% la pacienţii cu nivelul TK <10 U/L, faţă de 22% la cei cu nivelul TK >10 U/L. Astfel pacienţii cu un nivel TK >10 U/L prezintă un prognostic nefavorabil şi trebuie consideraţi pentru un tratament agresiv¹⁹.

În CLL lipsa mutaţiilor genei regiunii variabile a imunoglobilinei (IgV_H) este asociată cu un prognostic marcat nefavorabil chiar şi la pacienţii în stadiul A, dar secvenţierea genei IgV_H nu este disponibilă în majoritatea laboratoarelor, astfel că s-ar dori un surogat valid şi uşor de efectuat. Magnac et al. au arătat că un nivel al TK >15 U/L este un predictor independent puternic al statusului mutaţional al genei IgV_H, care se corelează cu potenţialul proliferativ, iar acesta permite discriminarea a două subgrupuri de pacienţi cu evoluţie clinică diferită¹¹.

Konoplev et al. au arătat în studiul lor, în care au determinat TK prin metoda de chemiluminiscenţă, că un nivel seric crescut al TK prezice o supravieţuire globală scăzută şi se corelează cu lipsa mutaţiilor genei IgV_H, expresia CD38 şi ZAP-70, nivelul β₂-microglobulinei serice şi dezvoltarea în continuare a sindromului Richter, aceleaşi aspecte fiind prezente şi la un subset de pacienţi trataţi cu regimuri terapeutice bazate pe fludarabină⁶.

▪ In limfoame TK a fost studiată în special între 1980 şi 1990, iar studiile efectuate au arătat că aceasta este crescută în special în formele agresive¹⁹.

Masaki et al. au studiat pacienţi cu limfom fără limfadenopatie superficială. În aceste cazuri estimarea creşterii tumorale, respectiv a numărului de celule tumorale, se face cu ajutorul unor parametri clinici cum ar fi sIL2R, deoxitimidin kinaza (dTK), β₂MG şi LDH. Concentraţiile serice ale sIL2R au fost mai mari în stadiul IV decât în stadiile I, II şi III, concentraţiile serice ale dTK au fost mai mari în stadiul IV decât în stadiile II şi III, iar concentraţiile serice ale β₂MG au fost mai mari in stadiul IV decât în stadiul I. Concentraţiile LDH nu s-au corelat cu stadiul tumoral. Niveluri extrem de mari ale sIL2R şi dTK pot fi observate la unii pacienţi cu limfoame care secretă citokine şi mediatori chimici atunci când survine inflamaţia secundară¹⁹.

Wakao et al. au arătat că TK serică şi receptorul solubil pentru IL-2 (sIL2R) sunt markeri sensibili şi intercorelaţi pentru recurenţa în limfomul malign, precum şi mai buni predictori ai recăderii decât LDH-ul şi IPI (International Prognostic Index)²¹.

În studiul lor, Poley et al. au arătat că în gamapatiile monoclonale nivelele serice ale TK sunt mai mici în gamapatiile monoclonale cu semnificaţie nedeterminată (MGUS) dacât în mielomul multiplu (MM), iar pacienţii cu MM stadiul I Durie-Salmon au nivele ale TK semnificativ mai mici decât cei cu stadii mai avansate. A existat o corelaţie între nivelul TK şi indexul de marcare al plasmocitelor. De asemenea nivelurile TK variază în funcţie de cursul bolii şi răspunsul la tratament, scăzând în remisiune şi crescând în recădere. TK s-a dovedit a fi un puternic indicator prognostic, după 2 ani 83% din pacienţii cu nivele pretratament ale TK <10 U/L fiind în viaţă, faţă de 47% din cei cu nivele ale TK ≥10 U/L. În alte limfoame non-Hodgkin pacienţii cu nivelul TK >10 U/L au avut o urmărire mediană de numai 7 luni, în timp ce cei cu nivele mai mici nici nu au atins timpul de supravieţuire median. Astfel determinarea TK poate ajuta în monitorizarea cursului clinic al limfoamelor non-Hodgkin pe durata tratamentului şi poate prezice prognosticul limfoamelor¹⁵.

Procházka et al. au studiat semnificaţia prognostică a nivelurilor serice de TK1 la 170 pacienţi înrolaţi prospectiv cu limfom folicular netratat. Nivelul TK1 la momentul iniţierii tratamentului s-a corelat cu stadiul clinic,  scorul FLIPI (Follicular Lymphoma International Prognostic Index), nivelurile β₂MG şi LDH şi simptomele B de boală. Nu s-a găsit nici o corelaţie cu gradul de limfom folicular şi cu indexul proliferativ Ki-67. Nivelele TK1 ≥15 U/L au fost identificate ca factor prognostic pentru supravieţuirea globală şi supravieţuirea fără progresie independent de variabilele scorului FLIPI¹⁶.

Într-un alt studiu, Suzuki et al. au studiat 55 pacienţi nou diagnosticaţi cu limfom cu celulă T periferică (PTCL) şi care au fost trataţi cu CHOP. La pacienţii cu niveluri ale TK crescute supravieţuirea globală a fost semnificativ mai mică, iar rata de răspuns globală a fost semnificativ scăzută¹⁷.

▪ Rolul TK a fost de asemenea studiat în sindroamele mielodisplazice (MDS). Aul et al. au determinat nivelul TK serice la 146 pacienţi cu MDS primare. 79% din pacienţi au prezentat niveluri crescute la diagnostic, cei cu stadii mai avansate de boală (RAEB, CMML, RAEB/T) prezentând niveluri mai mari în comparaţie cu cei în stadii precoce (RA şi RARS). Totuşi nivelurile TK nu s-au corelat cu procentul de blaşti medulari. Activitatea TK la diagnostic a furnizat informaţii prognostice, supravieţuirea la 2 şi 5 ani fiind mai mare la pacienţii cu nivelul TK <10 U/μL. Totuşi nivelurile TK la diagnostic nu au fost utile în predicţia transformării în leucemie acută mieloidă. Luând în considerare lipsa corelării cu blaştii medulari, autorii au concluzionat că creşterea nivelurilor TK în MDS este atributabilă în primul rând distrucţiei intramedulare a precursorilor hematopoietici, similar hematopoiezei ineficiente din deficitul de vitamină B12 asociată cu niveluri crescute ale TK şi LDH. TK este un parametru prognostic care poate fi folosit pentru predicţia supravieţuirii, totuşi valoarea predictivă a TK nu este superioară LDH¹.

Într-un alt studiu, Musto et al. au monitorizat nivelurile TK serice la 90 pacienţi cu MDS. Nici o corelaţie nu a fost găsită între nivelurile iniţiale de TK şi alţi parametri clinici sau de laborator. În urma analizei statistice a fost stabilit un cut-off de 38 U/μL, pacienţii cu valori ale TK >38 U/μL prezentând o supravieţuire semnificativ mai scurtă decât cei cu valori <38 U/μL (8,2 versus 37,4 luni). Leucemia acută mieloidă (AML) a apărut la 81% din cei cu TK >38 U/μL, faţă de 13% din cei cu niveluri mai mici la diagnostic, independent de subtipul FAB. De asemenea nivelurile TK crescute au fost utile pentru predicţia evoluţiei în AML în cursul evoluţiei bolii la pacienţii cu valori iniţiale normale. Astfel autorii au concluzionat că TK este un important factor prognostic în MDS care se corelează puternic cu dezvoltarea AML¹⁹.

▪ Rolul TK a fost studiat şi în leucemiile acute. Votava et al. au măsurat TK la 38 copii cu leucemie acută (34 limfoblastice, 4 mieloblastice), iar rezultatele au arătat niveluri foarte crescute la diagnostic (valoarea mediană = 403 U/L, normal <8 U/L), în timp ce în remisiune valorile au fost mult mai scăzute (valoarea mediană = 31 U/L), iar în recădere au crescut considerabil (valoarea mediană = 324 U/L). Studiul a arătat că creşterea nivelurilor TK serice în timpul perioadei de urmărire a fost un marker de ajutor în recunoaşterea într-un stadiu precoce a recăderii, în unele cazuri cu 1 lună înaintea apariţiei semnelor clinice. Sensibilitatea în acest caz a fost de 87%. Astfel nivelurile serice ale TK par a fi un bun parametru în perioada de urmărire datorită sensibilităţii acceptabile, costului scăzut şi eliminării necesităţii screening-ului măduvei osoase. Totuşi în acest studiu nivelurile TK la diagnostic nu s-au corelat cu prognosticul²⁰.

O`Neill et al. au măsurat nivelul TK1 la pacienţi cu ALL şi AML şi la un grup de pacienţi fără cancer prin 2 metode, radioenzimatică şi imunoenzimatică, cele două metode prezentând o corelaţie putenică între măsurători. Compararea valorilor medii ale TK1 la pacienţii cu ALL şi la indivizii sănătoşi a arătat diferenţe semnificative statistic între cele 2 grupuri, ceea ce confirmă măsurarea nivelului TK1 serice ca un instrument diagnostic. De asemenea rezultatele obţinute au arătat că activitatea TK1 serice este un bun indicator al răspunsului la tratament şi al stadiului bolii, nivelurile TK1 scăzând semnificativ la fiecare pacient care a răspuns la tratament şi a intrat în remisiune şi crescând la fiecare pacient care a recăzut¹⁴.

Există puţine date în privinţa rolului TK în tumorile solide, majoritatea provenind din anii 1994-1998.

▪ Cancerul de sân este cea mai comună formă de cancer şi a doua cauză de deces prin cancer la femeile din civilizaţia vestică. În ciuda progreselor obţinute în detecţia precoce şi în înţelegerea bazelor moleculare ale biologiei cancerului da sân, 30% din pacientele în stadiu precoce prezintă boală recurentă. Posibilitatea de a avea markeri prognostici şi/sau predictivi puternici este de cea mai mare importanţă pentru clinicieni în vederea identificării pacientelor cu riscul cel mai mare de recădere şi selectarea tratamentului cel mai potrivit pentru fiecare pacientă în parte. Un factor prognostic reprezintă o caracteristică clinică sau biologică măsurabilă asociată cu perioada de supravieţuire fără boală şi supravieţuirea globală independent de tratament, iar un factor predictiv reprezintă o caracteristică măsurabilă asociată cu răspunsul sau lipsa răspunsului la un tratament specific. După determinarea stadiului, gradului histologic şi a statusului receptorului hormonal, totuşi tumora poate avea o evoluţie neaşteptată şi prognosticul poate varia. O serie de factori prognostici şi predictivi au fost studiaţi în scopul explicării acestui fenomen, cum ar fi: expresia proteinei şi amplificarea genei Her-2/neu, expresia altor membri ai familiei receptorului factorului de creştere epitelială, fracţia fazei S, ploidia ADN, mutaţiile genei p53, ciclina E, disreglarea p27, prezenţa celulelor tumorale în circulaţie şi măduva osoasă, invazia spaţiului perineural şi limfovascular^3,19. În 2002 ASCO (American Society of Clinical Oncology) a discutat markerii prognostici relevanţi pentru cancerul de sân, iar recomandările lor includ numai receptorul pentru estrogen şi Her-2/neu, dar nu şi CEA, CA15-3 şi p53 datorită rezultatelor contradictorii. În plus, deoarece numai 25-30% din pacientele cu cancer de sân sunt Her-2/neu pozitive, utilitatea acestui marker poate fi limitată. Aceste date indică necesitatea de indicatori prognostici mai sensibili şi specifici⁴.

Nivele crescute ale TK au fost raportate în cancerul de sân. Svobodova et al. au arătat că valorile preoperatorii ale TK la un grup de 400 paciente cu cancer de sân au fost semnificativ mai mari decât la persoanele sănătoase, dar sensibilitatea TK a fost de 35% la o specificitate de 95%. De asemenea valorile din remisiune au diferit semnificativ de cele din prima progresie, iar valorile preoperatorii nu s-au corelat cu intervalul fără boală, dar s-au corelat cu supravieţuirea globală. O descoperire semnificativă a fost creşterea sensibilităţii TK la 3-6 luni înaintea progresiei, când sensibilitatea TK a fost mai mare decât a CA15-3 şi considerabil mai mare decât a CEA. Astfel testarea simultană a CA15-3 şi TK va creşte considerabil detectarea precoce a recăderii tumorale. Aceste rezultate sunt în acord cu datele publicate şi de alţi autori (O`Neill et al., Robertson et al., Kausitz et al.)^18;19.

Nisman et al. au studiat asocierea activităţii TK serice cu parametrii clinico-patologici şi prognosticul, în termenii supravieţuirii fără recurenţă, la 161 paciente cu cancer de sân. Nivelele TK serice au fost semnificativ mai mari la pacientele cu cancer de sân decât la femeile sănătoase şi s-au asociat cu stadiul T avansat, grad mai înalt, prezenţa necrozei tumorale, invaziei vasculare, lipsa expresiei receptorului pentru estrogen şi a receptorului pentru progesteron. De asemenea niveluri mai mari ale TK au fost prezente la pacientele cu mutaţii BRCA1/2 faţă de cele fără mutaţii. În urma analizei multivariate activitatea TK a fost găsită ca factor de prognostic independent pentru supravieţuirea fără recurenţă¹².

He et al. au măsurat concentraţia TK la 120 paciente cu cancer de sân cu risc scăzut la momentul intervenţiei chirurgicale şi la 67 paciente la 21 zile şi la 3 luni după operaţie. Concentraţia TK la 3 luni post-operator a fost mai mare la pacientele care au dezvoltat recurenţă la distanţă sau loco-regională. În schimb CA15-3 şi activitatea TK nu au fost sensibile în detecţia precoce post-operator a recurenţelor. Informaţiile obţinute ar putea fi folosite în decizia asupra terapiei adjuvante⁴.

▪ Kemik et al. au măsurat concentraţiile serice ale TK la 72 pacienţi cu adenocarcinom gastric. Nivelele TK s-au asociat cu stadiul tumoral avansat, prezenţa metastazelor, prezenţa adenopatiilor şi diferenţierea tumorală slabă, sugerând o posibilă semnificaţie prognostică⁵.

▪ Nisman et al. au măsurat nivelul plasmatic al piruvat kinakei tip M2 (TuM2-PK) şi activitatea TK preoperator la 116 pacienţi cu carcinom renocelular şi au găsit niveluri semnificativ mai mari în comparaţie cu participanţii sănătoşi dar nu şi faţă de cei cu tumori renale benigne. Nivelurile celor 2 markeri s-au corelat semnificativ cu stadiul T, dar numai TuM2-PK s-a corelat cu gradul tumorii, iar prezenţa necrozei tumorale extensive (>50%) s-a asociat cu TuM2-PK crescut şi TK1 scăzut. Ambii markeri s-au dovedit markeri predictivi independenţi pentru recurenţă. Astfel măsurarea acestor markeri înaintea intervenţiei chirurgicale poate fi utilă pentru stratificarea pacienţilor în grupe de risc pentru un posibil tratament adjuvant¹³.

▪ Li HX et al., Li Z et al., Korkmaz et al. au studiat activitatea TK serice în cancerul pulmonar non-microcelular arătând că nivelurile preoperatorii ale TK au fost semnificativ mai mari faţă de pacienţii sănătoşi, la pacienţii din grupul M0 corelându-se cu mărimea tumorii şi stadiul bolii, dar nu şi la pacienţii din grupul M1. Nivelul TK serice s-a dovedit un factor prognostic pentru monitorizarea răspunsului la chirurgie, iar la pacienţii cu cancer metastatic a reprezentat un factor prognostic independent pentru supravieţuirea fără progresie şi supravieţuirea globală^7;9;10.

Recomandări pentru determinarea timidin kinazei – utilă ca marker prognostic şi în monitorizarea leucemiei limfatice cronice, limfoamelor non-Hodgkin, leucemiilor; diferenţierea pacienţilor cu mielom multiplu de cei cu MGUS; posibil marker prognostic în cancerul de sân şi alte tumori solide.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate)⁸.

Specimen recoltat – sânge venos⁸.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant, cu/fără gel separator⁸.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare; serul se păstrează la -20°C⁸.

Volum probă – 1 mL ser⁸.

Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat, lipemic sau care conţine particule suspendate⁸.

Stabilitate probă – serul separat este stabil 12 luni la -20°C⁸.

Metodă – imunochimică cu detecţie prin chemiluminiscenţă (CLIA). Acesta este un test indirect în 2 timpi pentru determinarea cantitativă a TK. Iniţial are loc o reacţie enzimatică în care TK din probă transformă AZT în AZTMP, iar AZTMP este determinat cantitativ imunologic prin utilizarea de anticorpi anti-AZTMP⁸.

Valori de referinţă – 2 – 7,5 U/L.

Sensibilitate analitică: <0,5 U/L.

Sensibilitate funcţională: <5 U/L⁸.

Interpretarea rezultatelor: rezultatele vor fi coroborate cu alte date clinice şi de laborator.

Interpretarea acestui marker trebuie făcută numai în asociere cu evaluarea statusului clinic deoarece trebuie excluse alte cauze nespecifice de niveluri serice crescute: infecţii virale, în special herpes simplex şi zoster, boli autoimune, boli granulomatoase benigne (sarciodoză, hepatita cronică) şi, în mod particular, anemia pernicioasă^18;19.

O limitare a măsurării activităţii TK1 este variaţia substanţială a valorilor între pacienţi. Astfel modificări în activitatea TK1 serice sunt utile ca marker prognostic numai comparate cu probele anterioare ale pacientului, un nivel de bază trebuind să fie stabilit pentru fiecare pacient¹⁴.

Bibliografie