Acuratețea rezultatului și confirmarea diagnosticului COVID-19
Organizația Mondială a Sănătății (OMS) a stabilit că diagnosticul infecției COVID-19 se face doar prin identificarea virusului SARS-CoV-2, prin metoda RT-PCR (reacție de polimerizare în lanț). Proba se consideră pozitivă dacă se detectează două fragmente genice specifice coronavirusurilor, dintre care unul specific SARS-CoV-2.
Aceste informații au fost incluse într-un protocol stabilit de către Organizația Mondială a Sănătății (OMS), pe data de 2 martie 2020. În acest ghid sunt descrise și noțiunile de bază privind siguranța biologică pentru manipularea în condiții de securitate a microorganismelor patogene în laboratoare.
Conform autorităților de pe teritoriul țării noastre, până la această dată, acest tip de testare se poate efectua doar de către unități sanitare desemnate pe regiuni de către comisia Ministerului Sănătății, acreditate să primească și să acorde îngrijiri pacienților cu suspiciune/ infecție probabilă/ confirmată cu COVID-19 și să efectueze recoltarea probelor biologice pentru identificarea noului coronavirus.
Diagnostic COVID-19: metoda RT PCR
Procesarea probelor se poate face atât în laboratoarele de stat, cât și în cadrul laboratoarelor private contractate de către Direcția de Sănătate Publică (DSP), toate respectând normele de biosiguranță impuse de Organizația Mondială a Sănătății.
Disponibil în laboratoarele Synevo, testul ARN Viral SARS-CoV-2 evidențiază virusul SARS-CoV-2 prin tehnici de amplificare a materialului genetic viral – test RT-PCR – fiind specific pentru diagnosticul de laborator al infecției cu COVID-19.
Acuratețea rezultatelor depinde de întregul proces de testare
Obținerea cât mai rapidă a unor rezultate corecte de laborator implică o atenție sporită pe durata întregului proces de testare, ce a fost împărțit în trei faze: preanalitică, analitică și postanalitică.
- faza preanalitică (extra și intra laborator) – cuprinde toate etapele, de la pregătirea pacientului pentru recoltare și până la procesarea probei în laborator: conduita pacientului înainte de recoltare, recoltarea probelor biologice, transportul acestora la cel mai apropiat laborator (respectând condițiile de stabilitate) și depozitarea materialului biologic.
Setul minim de probe recomandat a se preleva pentru diagnosticarea COVID-19 include:
- Probe din tractul respirator superior (tampon sau spălătură nazofaringiană și orofaringiană) – se recomandă utilizarea de tampoane de Dacron sau poliester, cu tija de plastic și descărcarea ambelor tampoane de exsudat nazofaringian și faringian, în (același) tub cu mediu de transport pentru virusuri (VTM).
și/ sau
- Probe din tractul respirator inferior: spută (dacă este produsă) și/ sau aspirat endotraheal sau lavaj bronhoalveolar la pacienții cu afectare respiratorie severă.
- Suplimentar se pot preleva: sânge, materii fecale, urină, probe necroptice (țesut pulmonar).
Probele necesită condiții speciale de transport și temperaturi specifice pentru menținerea stabilității, așa cum sunt detaliate în documentul elaborat de Centrul Național de Supraveghere și Control al Bolilor Transmisibile. Probele care pot fi transportate rapid la laborator vor fi menținute la 2-8°C. Dacă durata de transfer a probei este mai mare – de la momentul recoltării până la momentul procesării probei în laborator – probele vor fi congelate (la -20°C sau ideal la -70°C) și transportate pe gheață carbonică.
| Tipul probei | Instrument prelevare | Transport | Conservare |
|---|---|---|---|
| Tampon nazofaringian și orofaringian | Tampon din Dacron sau poliester* | 2-8°C | ≤5 zile: 2-8°C>5 zile: -70°C |
| Lavaj bronho-alveolar | Recipient steril* | 2-8°C | ≤2 zile: 2-8°C>2 zile: -70°C |
| Aspirat endotraheal, aspirat sau spălătura nazofaringiană sau nazală | Recipient steril* | 2-8°C | ≤2 zile: 2-8°C>2 zile: -70°C |
| Spută | Recipient steril | 2-8°C | ≤2 zile: 2-8°C>2 zile: -70°C |
| Probe de țesut obținute prin biopsie sau necropsie (inclusiv țesut pulmonar) | Recipient steril cu soluție salină sau mediu de transport pentru virusuri (VTM) | 2-8°C | ≤24 ore: 2-8°C>24 ore: -70°C |
| Materii fecale | Coprorecoltor | 2-8°C | ≤5 zile: 2-8°C>5 zile: -70°C |
| Sânge integral | Tuburi recoltare sânge | 2-8°C | ≤5 zile: 2-8°C>5 zile: -70°C |
| Urină | Urocultor | 2-8°C | ≤5 zile: 2-8°C>5 zile: -70°C |
*Transportul probelor destinate detecției virale se va face în mediu suplimentat cu antifungice și antibiotice (VTM – viral transport medium). Se va evita înghețarea/dezghețarea repetată a probelor. Dacă nu este disponibil VTM, se poate folosi soluția salină, însă în acest caz stabilitatea probei la 2-8°C poate fi diferită de cea menționată în tabel.
Personalul medical responsabil cu prelevarea și transportul probelor va respecta recomandările Ghidului pentru Prevenirea și Controlul infecțiilor atunci când se suspectează o nouă infecție cu coronavirus (2019nCoV), indicații ce fac referire la echipamentul individual de protecție, la practicile corecte de manipulare a probelor, precum și a procedurilor de decontaminare.
- faza analitică are loc sub directa supraveghere a specialistului de laborator și reprezintă procesul tehnologic, etapa în care materialul biologic este procesat în laborator.
Pentru procesarea probelor, laboratoarele agreate respectă recomandările făcute de către Organizația Mondială a Sănătății, despre biosiguranță și biosecuritate cu privire la manipularea probelor contagioase – Cea de-a treia ediție a Manualului de Biosiguranță publicat de Organizația Mondială a Sănătății.
Identificarea virusului SARS-Cov-2 se efectuează în departamente de biologie moleculară, respectând standardele naționale de management al calității emis de RENAR pentru acreditarea laboratoarelor din România (SR EN ISO – 151819 din 2013).
Aparatul pe care se procesează probele de RT-PCR în laboratorul Synevo este cobas® 6800 systems.
Are o capacitate de a prelucra 96 de probe în 3h 1/2 sau 384 de probe în 8h.
Etapele de extracție, amplificare, și detecție a acizilor nucleici se fac automatizat.
Acuratețea rezultatelor este de 99,9%.
(sursa:https://www.dialog.roche.com/content/dam/dialog/owp/apac/Media/Molecular/cobas6800-8800_Brochure.pdf)
Fiecare testare prin Real Time RT-PCR trebuie să includă control intern – control pozitiv și control negativ. Controlul intern presupune testarea unor probe furnizate de producătorul kitului de reactiv cu rezultat cunoscut: pozitiv și negativ. Obținerea rezultatelor așteptate garantează corectitudinea rezultatelor pacienților. Controlul intern al calității se efectuează zilnic, cel puțin o dată la 8 ore și ori de câte ori este nevoie. Rezultatele controlului intern obținute se analizează de către specialistul responsabil de analiza respectivă, care semnalează erorile ce pot apărea în procesul de lucru.
Laboratoarele care efectuează testările pentru SARS-CoV-2 participă la scheme de control extern de calitate din momentul în care acestea devin disponibile – colaborarea cu alte laboratoare pentru compararea și confirmarea rezultatelor inițiale și îmbunătățirea performanțelor proprii este impusă de către OMS.
De asemenea, este necesară verificarea calității reactivilor la primire pentru a certifica absența contaminării.
- faza postanalitică – procedurile post-analitice efectuate în cadrul departamentului de biologie moleculară includ verificarea, interpretarea şi eliberarea rezultatelor.
Interpretarea rezultatelor
Rezultatele obținute pot fi:
- negative (nedetectabile) pentru cazurile în care nu au fost detectate țintele genice specifice în proba analizată;
- pozitive pentru probele în care au fost identificate țintele genice specifice virusului SARS-COV-2.
Unul sau mai multe rezultate negative, în special din probele prelevate de la nivelul tractului respirator superior, nu exclud posibilitatea infecției cu SARS-CoV-2.
Un rezultat fals-negativ poate fi explicat prin:
- prelevare necorespunzătoare, rezultând într-o cantitate redusă de produs patologic (se recomandă includerea unei ținte ADN umane în cadrul testării PCR);
- probă recoltată în stadii incipiente sau tardive ale infecției;
- probă manipulată și transportată necorespunzător;
- modificari genetice – mutații ale virusului;
- prezența inhibitorilor PCR.
În cazul unui rezultat negativ la un pacient cu o suspiciune fermă de infecție cu SARS-CoV-2 (în special din probele din tractul respirator superior), se pot preleva și testa probe suplimentare (de la nivelul tractului respirator inferior).
Identificarea unui alt agent patogen nu exclude infecția cu noul coronavirus, rolul coinfecției în patologie nefiind pe deplin cunoscut.
Pentru confirmarea eliminării virusului se recomandă repetarea prelevării până la obținerea de rezultate negative la două testări consecutive în interval de 24h, rezultate obținute prin reacții de amplificare genică – RT-PCR.
Toate rezultatele testărilor (pozitive sau negative) trebuie comunicate imediat autorităților naționale.
Acuratețea rezultatelor depinde de fiecare etapă de lucru, de pregătirea personalului medical, de tehnologia și dotările pe care laboratorul le deține, precum și de respectarea normelor și procedurilor recomandate de Organizația Mondială a Sănătății.
Până în prezent, în România s-au efectuat 237.280 teste, 9.528 fiind efectuate în Laboratorul Central Synevo (cifre actualizate la 08.05.2020).
Referințe:
https://www.slideshare.net/aureliaburduniuc1/controlul-de-calitate-in-laboratoare
https://www.ecdc.europa.eu/en/covid-19-pandemic
https://www.ecdc.europa.eu/en/novel-coronavirus/laboratory-support
https://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/
https://www.livescience.com/covid19-coronavirus-tests-false-negatives.html
