Borrelia-Anticorpi IgG, IgM (Blot)

Informaţii generale

Borrelia burgdorferi (B.b.) face parte din ordinul Spirochaetales, familia Spirochaetaceae, genul Borrelia şi a fost izolată în SUA, in anul 1982, din intestinul căpuşei Ixodes dammini, de catre Dr. Willy Burgdorfer, al cărui nume îl poartă².

Studiul diferenţelor antigenice dintre tulpinile izolate în America şi Europa (izolată din capușa Ixodes ricinus) a permis recunoaşterea implicării în patologia umană a trei genospecii care alcătuiesc complexul Borrelia burgdorferi sensu lato: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ce cuprinde toate tulpinile izolate în America de Nord) dar și B. garinii şi B. afzelii.

În Europa circulă toate cele trei genospecii, dar predomină B. garinii şi B. afzelii1;^2;4. În plus faţă de cele 3 genospecii menţionate s-a constatat recent implicarea, în unele cazuri din Europa, şi a unei alte specii: Borrelia spielmanii3. Odata cu descifrarea genomului bacterian al Borreliei s-au izolat numeroase antigene cu rol important în patogenie şi diagnostic².

Acest test este folosit ca metodă de confirmare (confirmă prezenţa anticorpilor IgM şi IgG specifici faţă de bacteriile aparţinând grupului Borrelia burgdorferi sensu lato), a rezultatelor pozitive şi echivoce obţinute prin screeningul serologic, realizat cu teste imunoenzimatice^1;2;3;4.

Antigenele specifice sunt produse prin recombinare, prin folosirea unor tulpini de E coli. În comparaţie cu lizatul convenţional, folosirea proteinelor recombinante prezintă un avantaj, deoarece este mimată exprimarea antigenică in vivo şi este oferită în acelaşi test si o combinaţie de antigene, provenite de la cele patru genospecii de Borrelia.

Spre deosebire de testele screening, testul de confirmare permite o detecţie selectivă a anticorpilor prezenți în diferitele etape ale infecţiei. Astfel, prezența de antigene tip OspC şi p41 este asociată cu răspunsul imun de tip IgM, în timp ce antigenele tip OspB, p39 şi p58 sunt biomarkeri cert asociaţi cu răspunsul imun de tip IgG. De asemenea, producerea de anticorpi sintetizati împotriva antigenului de tip VlsE este detectată ca și răspuns imun de tip IgG^2;3;4.

Pregătire pacient – preferabil à jeun (pe nemâncate)³.

Specimen recoltat – sânge venos³.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator³.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare³.

Volum probă – minim 2 mL ser³.

Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat, hemolitic sau contaminat bacterian³.

Stabilitate   probă   –  1 săptămână  la  2-8°C;   timp îndelungat la  –20°C;  evitaţi decongelarea/ recongelarea repetată.

Metodă – Microblot Array

Testul utilizează antigene relevante pentru diagnosticul serologic de infecție cu Borrelia si Anaplasma phagocytophilum:

• VlsE Ba, Bg, Bs: proteine de fuziune, reprezintă epitopii imunodominanţi tip VlsE ai diferitelor genospecii
• p83: proteina extracelulară rezultată din clivarea proteinei p100
• p58: transportor membranar (OppA-2 oligopeptid permeaza), biomarker de boala Lyme
• p41 Ba, Bs: proteină flagelară provenită de la burgdorferi sensu stricto, specifică pentru stadiul precoce al infecției
• p39 (BmpA): proteina 39 asociată membranei, specifică pentru stadiul avansat al infecției
• OspB: proteina de suprafață, specifică pentru stadiul avansat al infecției, se asociază cu artrita Lyme
• OspA Ba, Bg, Bs: proteină majoră de suprafaţă
• OspC Ba, Bg, Bs, Bsp: proteine de suprafaţă provenite de la: garinii, B sensu stricto, B. afzelii şi B. Spielmanii
• OspE: proteină de suprafață
• NapA: proteină de activare a neutrofilelor, biomarker pentru artrita Lyme
• p17: proteina membranară
• p44: biomarker pentru infecția cu Anaplasma phagocytophilum
• OmpA: proteina membranară a Anaplasma phagocytophilum, biomarker de virulență
• Asp62: proteină de suprafață
• TpN17: proteină membranară specifică Treponema pallidum
• Ba – B. afzelii,, Bg – B. garinii, Bsp – B. spielmanii., Bs – B. Burgdorferi sensu stricto.

Fig. 1 Distributia antigenelor pe placa de testare

 Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor:

Evaluarea intensității culorii spoturilor specifice pentru Borrelia si Anaplasma se face prin raportare comparativă la intensitatea culorii spoturilor- etalon (de calibrare) pe placă; se pot obține următoarele rezultate semicantitative:

< 6 AU (intensitate spot) – Negativ

6 – 7 AU – Echivoc

> 7 AU  – Pozitiv

Rezultatul final al testului se interpreteaza folosind un software specific (pentru MicroBlot- Array Reader), astfel:

Borrelia:

Anaplasma phagocytophilum:

Un rezultat negativ nu exclude infecţia cu Borrelia burgdorferi, în special la pacientii în stadiul I de boală, când, fie anticorpii nu sunt încă prezenţi, sau apariţia lor este întârziată, datorită inițierii unor tratamente cu antibiotice.

Un rezultat pozitiv nu indică o boala Lyme activă în toate cazurile, deoarece anticorpii de tip IgG persistă o perioadă lungă de timp şi pot proveni de la o infecţie veche cu Borrelia.

În probele provenite de la pacienţi aflaţi în primele stadii de boală, predomină anticorpii din clasa IgM, reacţia faţă de proteina OspC fiind caracteristică răspunsului imun precoce.

În stadiile tardive ale bolii, serul va conţine anticorpi de tip IgG, aceştia generând apariţia unor benzi intense în zonele p58 şi p39. Proteina VlsE este un biomarker precoce pentru răspunsul de tip IgG, dar se identifică adesea şi in cadrul răspunsul imun ce însoțeste manifestările tardive ale borreliozei.

Prezenta anticorpilor anti-Borrelia în LCR este sugestivă pentru afectarea neurologică din boala Lyme³.

Limite şi interferenţe

Prin folosirea unor antigene recombinante selective, din structura Borrelia, se exclud reacţiile încrucişate care ar putea să apară în cadrul unor infecții, precum : sifilis, febră recurentă sau leptospiroză.

Totuşi, în cazul unei infecţii active sau al unor antecedente de infecție cu Treponema pallidum, serurile pot să conțină uneori anticorpi îndreptați împotriva antigenelor tip p41 sau p41/i, în această situaţie fiind necesare teste de excludere a acestei infecții (VDRL şi TPHA)².

Este obligatoriu ca testele serologice să fie corelate întotdeauna cu anamneza şi datele clinice.

Dacă există totuşi suspiciune clinică de boală Lyme, iar rezultatul testării este negativ sau echivoc, se recomandă repetarea recoltării, după 3 săptămâni¹.

Bibliografie:

1. Bettina Wilske, Barbara J.B. Johnson, Martin E. Schriefer: Borrelia. In Manual of Clinical Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H. Jorgensen, Marie Louise Landry, Michael A.Pfaller, ASM PRESS, USA, 9 ed. 2007; 62: 971-987.
2. Koneman’s: Spirochetal In Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Lippincott Williams& Wilkins, 6 ed 2006; 20: 1125 – 1151.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate. Ref Type: Catalog
4. Rocco LaSala P., Michael B. Smith: Spirochete Infections In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 21 2007; 58: 1059 – 1074.